genhunter:AP-TAG 试剂盒概述

genhunter:AP-TAG 试剂盒概述

AP-TAG 技术改变了细胞表面受体和配体的检测和克隆方式。本发明的本质是允许编码受体的任何分泌性多肽配体或胞外结构域的cDNA序列符合读码框地融合至pAPtag克隆载体中的人胎盘分泌性碱性磷酸酶(AP)。所得配体-AP 融合蛋白(称为 AP-body)在 293T 或 CHO 细胞中表达时,可以高水平分泌到培养基中,因此可以通过 AP 活性测定或使用抗 AP 抗体的蛋白质印迹分析轻松检测到。因此,配体-AP或可溶性受体-AP融合蛋白可以像抗体一样充当亲和剂,从而可以方便、安全和灵敏地检测和克隆其相应的细胞表面受体或配体。与传统的放射性125I标记方法不同,AP-TAG是安全的,不需要配体/可溶性受体纯化。

自发明以来,AP-TAG技术已克隆了许多重要的细胞表面受体和配体,包括Leptin、Semaphorin III、Nogo-66、IL-24、Jelly Belly的受体以及Kit、Mek4和Sek受体酪氨酸激酶的配体。

如果您正在使用通过 DD 或其他方法克隆的分泌蛋白或细胞表面分子,AP-TAG 技术可以让您进一步对这些基因进行功能表征。

AP-TAG Kit B

用于受体/配体相互作用的非放射性检测。

 

这种单向量系统是第三代AP-TAG技术。分泌型配体或可溶性受体可以与分泌型碱性磷酸酶(AP)在其N端或C端融合以产生“AP体”。所得的 AP 融合蛋白可以作为分泌蛋白表达,并直接用作高度敏感的亲和剂,就像抗体一样。表位标签(6xHis 和 myc)可以轻松纯化、检测和相互作用测定 (IP) AP 融合蛋白。下面列出了其他改进的功能。

AP-TAG Kit A

用于受体/配体相互作用的非放射性检测。

 

这是使用 pAPtag-2 和 pAPtag-4 载体的第二代 AP-TAG 技术。分泌型配体或可溶性受体可以与分泌型碱性磷酸酶(AP)在其N端或C端融合以产生“AP体”。所得的 AP 融合蛋白可以作为分泌蛋白表达,并直接用作高度敏感的亲和剂,就像抗体一样。

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品


磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品




Phos-tag™是一种可特异性捕获磷酸化Ser、Thr、Tyr等物质的功能分子,由日本广岛大学大学院医齿药学综合研究科医学品分子机能科学研究室开发。以Phos-tag™ 丙烯酰胺(Phos-tag™ Acrylamide)为首开发的多种Phos-tag™ 产品被应用于世界范围内的基础研究,并且在GPCR通路及Wnt通路的信号转导分析方面也取得了优秀成果。

◆分离磷酸化蛋白!


在制备SDS-PAGE预制胶过程中加入Phos-tag™ Acrylamide,即可根据磷酸化水平和磷酸化位点分离磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。

原理


磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品


1. 电泳中的磷酸化蛋白捕获2个二价金属离子。

2. 磷酸化水平越高电泳速度越慢。

3. 根据磷酸化水平进行分离。(即使磷酸化位点的数目相同,但只要位置不同就能分离)


特点

● 可检测市售抗磷酸化抗体无法检测的磷酸化蛋白。

● 可检测磷酸化水平及磷酸化位点。

● 可同时检测磷酸化与非磷酸化

Phos-tag™实验指导手册,点击此处查看

从制作Phos-tag™ SDS-PAGE预制胶开始,Phos-tag™ 相关信息一览


◆实验数据


① α-casein去磷酸化反应随时间的变化


磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

使用碱性磷酸酶随时间(孵育时间:0-120 min)处理α-casein(产品编号:038-23221),并使用Phos-tag™ SDS-PAGE和常规SDS-PAGE分离去磷酸化处理的样品。

② 野生型/突变型Noxa表达的MCL-1磷酸化水平变化

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

使野生型(wt)及突变型(3E,KR,5A)的Noxa在肺小细胞癌细胞株H209细胞中表达,并进行细胞溶质(Cytosol)组分和HM(Heavy Membrane,含线粒体较多)组分分离。通过Phos-tag™ SDS-PAGE分离出样品中的MCL-1(40 kDa),使用抗MCL-1抗体进行Western blotting检测。


【数据提供】

日本医科大学 先进医学研究所 基因控制部门 中嶋亘

③ 二维电泳中的应用: hnRNP K异构体的磷酸化分析

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

通过免疫沉淀法,从经LPS刺激后的小鼠巨噬细胞J774.1的细胞核提取液中,分离得到hnRNP K。在二维电泳中,一维使用IPG胶(pH 4.7-5.9),二维使用Phos-tag™ SDS-PAGE,分离hnRNP K的异构体(66 kDa,64 kDa)。使用质谱仪可以确认不同的点代表不同的异构体或修饰位点。


【数据提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业,木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)理化学研究所RCAI 小原收

产品列表

产品编号

生产商编号

产品名称

包装

304-93521

AAL-107

Phos-tag Acrylamide AAL-107

Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107

10 mg

300-93523

AAL-107M

2 mg

304-93526

AAL-107S1

Phos-tag Acrylamide AAL-107 5 mM Aqueous Solution

Phos-tag™ 丙烯酰胺AAL-107 5 mM液体型

0.3 mL

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◆检测磷酸化蛋白!

 

Phos-tag™ Biotin

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

Phos-tag™ Biotin是Phos-tag™ 分子与生物素结合的产品,无需使用抗磷酸化抗体即可检测与PVDF膜上的磷酸化蛋白。

本产品进需配合“HRP 结合亲和素”进行使用。

特点

● 结合与磷酸化种类无关

● 推荐用于检测无合适的抗磷酸化抗体的蛋白


产品列表

产品编号

生产商编号

产品名称

包装

301-93531

BTL-104

Phos-tag Biotin BTL-104

Phos-tag™ 生物素BTL-104

10 mg

308-97201

BTL-111S1

Phos-tag Biotin BTL-111 1 mM Aqueous Solution

Phos-tag™ 生物素1 mM水溶液

0.1 mL

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Phos-tag™ 凝胶荧光染料

Phos-tag™ 凝胶荧光染料,是一种可在生理 pH 范围内,对凝胶中的磷酸化蛋白进行染色的荧光染料。进行SDS-PAGE后,用本产品处理聚丙烯酰胺凝胶,可以对磷酸化蛋白进行特异性染色。本系列有波长不同的Yellow(黄)、Magenta(品红)、Cyan(蓝绿)、Aqua(浅绿)四种颜色。每管规格为0.2 mg,可对约20个迷你凝胶进行染色。

实验数据

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

使用Phos-tag™ 荧光凝胶染色,筛选组氨酸激酶抑制剂。结果表明,激酶抑制剂对磷酸化存在浓度依赖性抑制。


【数据提供】

广岛大学大学院 医学科学研究科 医药分子机能科学研究室 木下惠美子,木下英司,小池透

产品列表

产品编号

生产商编号

产品名称

包装

382-15201

nPGS-A01

Phos-tag™ Aqua

Phos-tag™ 浅绿荧光染料

0.2 mg

389-15211

nPGS-C01

Phos-tag™ Cyan

Phos-tag™ 蓝绿荧光染料

0.2 mg

380-15241

nPGS-Y01

Phos-tag™ Yellow

Phos-tag™ 黄色荧光染料

0.2 mg

386-15221

nPGS-M01

Phos-tag™ Magenta

Phos-tag™ 品红荧光染料

0.2 mg

383-15231

nPGS-MR1

Mixed reagents for Phos-tag™ Common Solution 5×

Phos-tag™ 5×染色通用混合溶液

1个

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◆纯化磷酸化蛋白!


磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品



产品列表

产品编号

生产商编号

产品名称

包装

385-20061

nMG-303

Phos-tag™ MG-Bead

100 μL

387-07321

AG2-103

Phos-tag™ Tip

Phos-tag™ 琼脂糖吸管

8支

302-93561

AG-501

Phos-tag™ Agarose*

Phos-tag™ 琼脂糖

0.5 mL

308-93563

AG-503

3 mL

*此产品由Manac Inc.生产并销售。

◆质谱分析磷酸化蛋白

Phos-tag™ 质谱分析用试剂盒(产品编号:305-93551)通过与MALDI-TOF/MS的样品进行混合,即用于磷酸化蛋白的质谱分析。本产品包含三种不同的分子量的Phos-tag™ 分子。

磷酸化蛋白分析用——Phos-tag™ 系列产品

产品列表

产品编号

生产商编号

产品名称

包装

305-93551

MS-101KIT

Phos-tag Mass Analytical Kit

Phos-tag™ 质谱分析试剂盒

1套


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※ 本页面产品仅供研究用,研究以外不可使用。