荧光显微镜的工作原理

荧光显微镜：荧光显微镜是利用紫外光作为光源照射被检物体，使其发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状和位置。

荧光显微镜用于研究细胞内化学物质的吸收、运输、分布和定位。细胞内的某些物质，如叶绿素，受紫外线照射后能发出荧光；有些物质本身不能发出荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色，在紫外线照射下也能发出荧光。对此类物质进行定性和定量研究的工具之一。

确认

荧光显微镜与普通显微镜有以下区别：
1、照明方式通常为落射照明，即光源通过物镜投射到样品上；
2、有两片特殊滤光片，光源前面的一片用于滤除可见光，目镜与物镜之间的一片用于滤除紫外线，保护人眼。
荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要区别在于两者的激发波长不同。这就决定了荧光显微镜与普通光学显微镜在结构和用途上的差异。
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的重要工具。它由光源、滤光板系统和光学系统等主要部件组成。它是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大观察标本的荧光图像。

工作准则

光源
多采用200W超高压汞灯作为光源。它由石英玻璃制成，中间呈球形，里面充有一定量的水银。工作时，两个电极之间放电使汞蒸发，球内压力迅速升高。当汞全蒸发时，可达到50至70个标准大气压，这个过程一般需要5至15分钟左右。超高压汞灯的发光是电极间放电使汞分子不断解离还原时发射光量子的结果。它发出强烈的紫外线和蓝紫色光，足以激发各种荧光物质，因此常用于荧光显微镜。
超高压汞灯也会释放大量的热能。因此，灯室必须具有良好的散热条件，工作环境温度不宜过高。
新型超高压汞灯在使用初期无需高压即可点燃。使用一段时间后，需要用高压（15000V左右）启动。启动后，维持工作电压一般为50-60V，工作电流为4A左右。 200W超高压汞灯每次使用2小时，平均寿命约为200小时。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效逐渐降低。灯熄灭后，等待其冷却后再重新启动。点亮后不要立即关闭灯泡，以免汞蒸发不全而损坏电极，一般需要等待15min。由于超高压汞灯压力高，紫外线强，灯泡必须放入灯室内才能点燃，以免伤眼和爆炸。
超高压汞灯（100W或200W）的光源电路包括变压、镇流器、启动等几部分。灯箱上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡灯泡后面安装有镀铝凹面反射镜，前面安装有聚光透镜。

滤色镜系统
滤色镜系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤光板和压滤光板组成。滤板的型号、各厂家的名称往往不统一。滤光板一般以基本色调来命名，前面的字母代表色调，后面的字母代表玻璃，数字代表型号特征。例如德国产品（肖特）BG12是一种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；有一些厂家的滤板全用数字命名，如美国康宁厂的滤板。 NO：5-58，相当于BG12。

1.激发滤光板根据光源和荧光颜料的特性，可以选择以下三种类型的激发滤光板，以提供一定波长范围内的激发光。
紫外光激发滤光片：该滤光片可透过400nm以下的紫外光，阻挡400nm以上的可见光通过。常用的型号有UG-1或UG-5，再加一个BG-38来消除红色尾流。
紫外蓝光激发滤光板：该滤光板可以通过300-450nm范围内的光。常用型号有ZB-2或ZB-3，加上BG-38。
紫蓝色激发滤光片：可通过350～490nm的光。常用型号为QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的荧光素（如罗丹明色素）可以被蓝绿色滤光板（如B-7）激发。
使用金属膜干涉滤光片。由于其针对性强、波长合适，激发效果比玻璃滤光片更好。例如西德Leitz工厂的FITC专用KP490滤板和罗丹明的S546绿色滤板都远远优于玻璃滤板。
激励滤光片分为薄型和厚型两种。一般暗视野使用较薄的滤光板，明视场荧光显微镜可使用较厚的滤光板。基本要求是获得最亮的荧光和好的背景。

2、压制滤光板 压制滤光板的作用是全阻挡激发光的通过，并提供相应波长范围内的荧光。与激发滤光板相对应，常用的有以下三种压制滤光板：
紫外光压制滤光板：可透过可见光，阻挡紫外线透过。可与 UG-1 或 UG-5 结合使用。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫蓝压滤板：可通过波长510nm以上（绿至红）的光，可与BG-12组合使用。通常使用OG-4K510或OG-1K530。
紫外压制滤光板：可透过波长460nm以上（蓝到红）的光，可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490、K510。

反光罩
反光罩的反射层一般采用镀铝，因为铝在紫外光和可见光的蓝紫光区吸收较少，反射率在90%以上，而银的反射率只有70%；一般采用平面反射器。

专
为荧光显微镜设计的聚光镜由石英玻璃或其他传输紫外线的玻璃制成。有光场聚光镜和暗场聚光镜两种。还有相衬荧光聚光器。
1. 明场聚光镜 明场聚光镜常用于一般荧光显微镜。聚光能力强，使用方便。特别适合低倍和中倍放大标本的观察。
2. 暗视野聚光镜 暗视野聚光镜越来越多地用于荧光显微镜。因为激发光不直接进入物镜，除了散射光外，激发光不进入目镜。可以使用薄的激发滤光片来增强激发光的强度，并且压滤光片也可以很薄。无色滤光片（无紫外线透射），同时仍产生深色背景。从而增强了荧光图像的亮度和对比度，提高了图像质量，观察舒适，并且可以发现明场中难以区分的细小荧光颗粒。
3、相衬荧光聚光镜 相衬聚光镜与相衬物镜配合使用，可以同时进行相衬和荧光相结合的观察，既可以看到荧光图像，又可以看到相衬图像。有助于荧光的准确定位。一般荧光观察很少需要这种聚光镜。

物镜
可以使用多种物镜，但优选消色差物镜，因为它的自发荧光最小，并且其透射率（波长范围）适合荧光。由于显微镜视场内图像的荧光亮度与物镜孔径比的平方成正比，与其放大倍数成反比，因此为了提高荧光图像的亮度，需要采用大孔径的物镜。应使用孔径比。尤其是在高倍放大下，其效果非常明显。因此，对于荧光不足的标本，应使用大孔径比的物镜，目镜尽可能低（4×、5×、6.3×等）。

目镜
在荧光显微镜中使用低倍目镜，例如 5× 和 6.3×。过去经常使用单目目镜，因为其亮度是双目目镜的两倍以上，但研究型荧光显微镜大多使用双目目镜，观察非常方便。
落射光装置
新型落射光器件是光源发出的光照射到干涉分光滤光片后，由于滤光片上涂层的性质，短波长部分（紫外线和紫蓝色）被反射。当滤光片面向光源时，为45度。倾斜时垂直射向物镜，然后通过物镜射向标本，使标本受到激发，物镜直接起聚光作用。同时，滤光片的长部分（绿色、黄色、红色等）对于滤光片来说是透明的。因此，它不会反射向物镜，并且滤光片充当激发滤光片。由于标本的荧光处于可见光波长范围内，可以通过滤光片到达目镜进行观察，荧光图像的亮度随着放大倍数的增加而增加，并且在高放大倍数下比透射光源更强。除具有透射光源的功能外，更适合直接观察不透明和半透明标本，如厚片、滤光片、菌落、组织培养标本等。研制的新型荧光显微镜大多采用落射光器件，称为落射荧光显微镜。研制的新型荧光显微镜大多采用落射光器件，称为落射荧光显微镜。研制的新型荧光显微镜大多采用落射光器件，称为落射荧光显微镜。

CCD

简介
荧光显微镜CCD是与荧光显微镜密切相关的数码相机产品。一方面可以将荧光显微镜拍摄的显微摄影产物通过USB接口传输至计算机，方便图像采集和研究。另一方面，通过荧光显微镜CCD我们可以比单独使用荧光显微镜拍摄更好的照片。荧光显微镜CCD可与荧光显微镜连接构成显微成像系统。

使用范围
一般情况下，单独使用荧光显微镜就可以达到理想的成像效果，但在某些情况下，比如当荧光比较弱时，单独使用荧光显微镜无法达到理想的拍摄效果，或者我们希望您可以上传拍摄的照片荧光图像传输至计算机，用于预览、修改甚至发表学术论文。这时如果没有荧光显微镜CCD就无法满足要求。

特点
荧光显微镜CCD一般具有良好的弱光捕获能力，可以捕获极弱的荧光，因此成像能力良好。另外，不少荧光冷CCD生产公司都对CCD进行了这样的制冷处理，使得该类CCD的噪声大大增加。减少，信噪比可以大大提高。由于其方便的应用效果，此类CCD相机广泛应用于荧光显微镜中。

标本制备要求

荧光显微镜的标本制备要求
1. 载玻片
载玻片的厚度应在 0.8 至 1.2 毫米之间。一方面，如果坡度太厚，会吸收更多的光，另一方面，激发光不能集中在标本上。载玻片必须光滑、厚度均匀且无明显自发荧光。有时使用石英玻璃载玻片。

2、盖玻片
盖玻片厚度约为0.17mm，光滑、洁净。为了加强激发光，还可以使用干涉盖玻片，它是一种特殊的盖玻片，上面镀有几层物质（如氟化镁），这些物质对不同波长的光有不同的干涉效果。平滑地通过，同时反射激发光，该反射的激发光可以激发样本。

3、标本
组织切片或其他标本不宜太厚，太厚则大部分激发光消耗在标本下部，物镜直接观察的上部激发不够充分。另外，细胞的重叠或杂质的掩蔽也会影响判断。

4.封固剂
甘油是常用的封固剂。它必须是无色透明且无自发荧光的。 pH值8.5~9.5时荧光亮度较亮，且不易快速消失。

5、镜油
一般用暗场荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油。最好使用专用的非荧光镜片油。也可以使用上述的甘油来代替。也可以使用液体石蜡，但折射率较低，图像质量略有影响。影响。

指示

(1)打开光源，超高压汞灯需要预热15分钟才能达到最亮点。
(2)对于透射型荧光显微镜，应在光源和暗场聚光镜之间安装所需的激发滤光片，并在物镜后面安装相应的压滤光片。对于落射荧光显微镜，需要将所需的激发滤光片、二色分束器和压滤光片插入件插入光路中的槽中。
(3)用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置调节光源中心，使其位于整个照明光斑的中心。
(4) 放置标本片，调焦后观察。使用时应注意：未安装滤光片时请勿用眼睛直接观察，以免造成眼睛损伤；用油镜观察标本时，必须使用无荧光的专用镜油；高压汞灯关闭后，不能立即再次打开，需要等待。水银灯必须全冷却后才能重新启动，否则会不稳定，影响水银灯的寿命。
(5)观察。例如，在荧光显微镜下使用蓝紫色滤光片，观察用0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光（深绿色和橙红色）。

防范措施

(1)严格按照荧光显微镜出厂说明书的要求进行操作，不得随意改变程序。
(2)检查应在暗室中进行。进入暗室后，接通电源，点亮超高压汞灯5-15分钟。光源发出的强光稳定后，眼睛全适应暗室，然后开始观察标本。
(3)为防止紫外线对眼睛的伤害，调节光源时应戴防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2小时为宜。如果超过90分钟，超高压汞灯的发光强度会逐渐下降，荧光也会减弱；标本经紫外线照射3～5分钟后，荧光也会明显减弱；因此，不应超过2至3小时。
(5)荧光显微镜光源的寿命有限，应集中检查标本，以节省时间并保护光源。天气炎热时，应加风扇降温，并从更换新灯泡时开始记录使用时间。灯泡熄灭后想再次使用时，必须等灯泡冷却后再点亮。应避免每天多次点亮光源。
(6) 染色后立即观察标本，随着时间的推移荧光会逐渐减弱。如果将标本保存在4℃的聚乙烯塑料袋中，可以延迟荧光减弱时间，并可以防止封片剂蒸发。激发光长期照射标本会引起荧光衰减和消失，因此应尽量缩短照射时间。暂时不观察时可用遮光罩遮挡激发光。
(7)观察标本时应使用非荧光油，并避免眼睛直视紫外光源。
(8)电源应配备稳压器，电压不稳定会降低日光灯的寿命。

荧光显微镜与普通显微镜有以下区别：
1、照明方式通常为落射照明，即光源通过物镜投射到样品上；
2、光源为紫外光，波长较短，分辨率比普通显微镜高；
3、有两片特殊滤光片，光源前面的一片用于滤除可见光，目镜与物镜之间的一片用于滤除紫外线，保护人眼。
荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要区别在于两者的激发波长不同。这就决定了荧光显微镜与普通光学显微镜在结构和用途上的差异。
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的重要工具。它由光源、滤光板系统和光学系统等主要部件组成。它是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大观察标本的荧光图像。