ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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介绍

ELISA(酶联免疫吸附测定)是蛋白质检测的“金标准”方法。1在本博客中,回顾了三种流行的 ELISA 平台:标准 ELISA免疫 PCR单分子阵列 (SIMOA)。我们将对这些 ELISA 的设计原理、样本量、仪器和灵敏度进行比较。

ELISA 的工作原理

ELISA的基本设计原理取决于抗体-抗原相互作用的稳定性和特异性。简而言之,固定在珠子或微孔板等固体基质上的捕获抗体可与多种样品类型中的目标蛋白结合。此类样品可包括血浆、血清、细胞和组织裂解物、条件培养基或尿液

1971 年引入 ELISA 时,酶标记抗原被纤维素颗粒上的抗体捕获。2然后通过反复离心和洗涤分离抗体-抗原缀合物。此后,不同的 ELISA 格式被开发出来,包括夹心 ELISA,其中目标蛋白“夹在”捕获抗体和标记检测抗体之间(图 1)。这种 ELISA 格式具有高度特异性,因为需要两种抗体与蛋白质结合才能进行检测。此外,可以用标准曲线确定蛋白质浓度(即定量数据)。ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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图 1. 夹心 ELISA 使用两种抗体来靶向蛋白质,从而具有高特异性。

这里讨论的 ELISA 平台——标准 ELISA免疫 PCR单分子阵列 (SIMOA) ——是生成定量数据的夹心 ELISA。然而,它们在底物、检测方法、仪器、样品体积和灵敏度方面有所不同。

标准酶联免疫吸附试验

标准 ELISA (sELISA) 将捕获抗体固定到透明塑料 96 孔微孔板上(图 2、表 1)。该检测抗体与辣根过氧化物酶 (HRP) 结合,该酶可将其底物 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB) 还原为蓝色和氧化形式。颜色的变化与 HRP 的量成正比,并且推论与样品中目标蛋白的量成正比。添加硫酸可终止 HRP-TMB 反应,导致颜色从蓝色变为黄色。使用酶标仪在 450 nm 处测量吸光度


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图 2. 标准 ELISA 的工作原理。标准 ELISA 使用 HRP 偶联的检测抗体和比色底物来检测捕获的蛋白质。
标准 免疫PCR SIMOA
基质 96孔微孔板 96孔PCR板 珠子
检测方法 比色法 聚合酶链式反应 荧光
乐器 读板器 实时荧光定量PCR仪 专用仪器
样品量* 100微升 10-25 µL 125微升
灵敏度 高的 更高 最高

表 1. 标准 ELISA、免疫 PCR 和单分子阵列 (SIMOA) 的比较。 * = 样品稀释后每次重复的最终体积。

sELISA 的灵敏度一般范围为 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而,一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亚 pg/ml 或高达 10 ng/ml。与所有 ELISA 一样,灵敏度取决于所用抗体的灵敏度。

对于标准 96 孔板,最终样品体积为每孔 100 µL。使用“半面积”板可以减少体积 (50 µL) ,其中孔的直径为一半宽,但测定灵敏度也可能会降低。用于任何ELISA 的原始样品体积将取决于最佳样品稀释度,该稀释度会因蛋白质、样品类型和实验而异。

将样品添加到板中后,大约 5 小时内即可获得结果。然而,当样品和抗体同时添加到板中时,可以实现更快的周转时间。这减少了孵育步骤和洗涤步骤的数量。例如,SpeedELISA的处理时间为 3 小时,在添加样品之前同时孵育板上的捕获检测抗体。其他方法包括一步添加样品和两种抗体,或者将样品和检测抗体一起添加。然而,减少处理时间会降低灵敏度(图 3)。ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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图 3. 多步 sELISA 和SpeedE LISA 在灵敏度和检测范围方面的比较。针对人 (A) CD26 和 (B) 可溶性 IL-6 受体 (IL-6 sR) 的标准曲线数据。两种测定均使用相同的标准品和抗体对。使用 RayBiotech Life, Inc.(Peachtree Corners,GA;美国)的 sELISA 和 SpeedELISA 试剂盒对人 CD26 和 IL-6 sR 进行分析(CD26:sELISA 试剂盒货号 ELH-CD26,SpeedELISA 试剂盒货号 ELHS-CD26)( IL-6 sR:sELISA 试剂盒目录号 ELH-IL6sR,SpeedELISA 试剂盒目录号 ELHS-IL6sR)。 OD = 光密度。

sELISA 的主要优点是提供低成本试剂盒,可以针对来自多个物种的数千种不同蛋白质。此外,sELISA 几乎不需要培训,可生成易于解释的数据,并使用与其他检测兼容的经济实惠的酶标仪。这些优点导致 sELISA 在研究中得到广泛使用。

免疫PCR (IQELISA TM )

免疫 PCR也称为免疫定量 ELISA (IQELISA),将捕获抗体粘附到塑料 96 孔 PCR 板上,同时检测抗体与 DNA 条形码缀合(图 4、表 1)。使用 PCR,双链 (ds) DNA 条形码在条形码特异性引物和与 dsDNA 结合的荧光染料存在的情况下分别被扩增和染色。荧光与 dsDNA 的量成正比,因此也与样品中目标蛋白的量成正比。使用实时 PCR 仪器测量荧光。

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图 4. 免疫 PCR 的工作原理。免疫 PCR 使用 DNA 条形码检测抗体和 dsDNA 荧光染料来检测捕获的蛋白质。

IQELISA 的一个优点是其体积要求小,每次重复的最终体积仅为 10 µL。因此,当样品量有限或难以获得样品时,IQELISA 是一个特别有吸引力的选择。然而,IQELISA 比 sELISA 在技术上更具挑战性,因为它需要更精确的移液。此外,样品应至少重复三次,因为小体积会增加异常值的机会。

DNA 通过 PCR 扩增循环呈指数增长。因此,与使用相同抗原和抗体对的 sELISA 相比,IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。灵敏度的增加取决于抗体,范围从无变化到 105 倍(图 5)。

从样品孵育到数据收集,IQELISA 大约需要 5.5 小时。该周转时间与 sELISA 类似。

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图 5. sELISA 和免疫 PCR 对 28 种蛋白质的敏感性比较。 sELISA 和免疫 PCR ELISA 均使用每个靶标的相同标准品和抗体对。该图和图 8 使用相同的 RayBiotech Life, Inc. 的 sELISA 试剂盒和 IQELISA 试剂盒。

单分子阵列 (SIMOA TM )

SIMOA是一种超灵敏 ELISA,使用抗体包被的珠子和荧光偶联的检测抗体(图 6、表 1)。将珠子、样品和检测抗体混合在一起后,将溶液施加到具有超过 235,000 个微孔的卡盒中。每个微孔只能容纳一颗珠子。然后将油添加到卡盒中,将样品推过微孔阵列的表面并形成孔的液密密封。

使用配备荧光显微镜的全自动或半自动系统测量荧光;该仪器由 SIMOA( Quanterix ;Billerica,MA;美国)开发商制造。由于每个孔只能包含一个珠子,因此具有荧光的微孔的数量与样品中目标蛋白的量成正比。这使得单分子检测成为可能。

ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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图 6. 单分子阵列的工作原理。 SIMOA 使用荧光偶联检测抗体和微孔来检测捕获的蛋白质。

SIMOA 的一个关键优势是它可以检测飞摩尔范围内的蛋白质。也就是说,灵敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范围内。与 sELISA 和 IQELISA 相比,SIMOA 的平均灵敏度分别提高了 465 倍和 63 倍。

将试剂装入 Quanterix 仪器后,大约需要 3 小时才能获取数据。因此,SIMOA 的程序时间比 sELISA 和 IQELISA 都短。

虽然 SIMOA 实现了此处评测的三个平台中的一些最高灵敏度,但该技术也有一些缺点。首先,目前使用该技术分析的蛋白质数量很少(~165)。其次,SIMOA 试剂盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 试剂盒。第三,检测仪器价格昂贵,且只能用于SIMOA,是专用仪器,需要专门培训才能运行。

ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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图 7. sELISA 和 SIMOA 在灵敏度和检测范围方面的比较。通过将纯化的人(A) IL-6 或(B) TNA α 添加到缓冲液中生成标准曲线数据。 RayBiotech Life, Inc. 的每个靶标的相同标准品和抗体对用于 sELISA 和 SIMOA(IL-6,sELISA 目录号 ELH-IL6;TNF α,sELISA 目录号 ELH-TNF)。 Y 轴 = 标准化信号,其中减去空白信号。信号 = sELISA 450 nm 处的 OD 或 SIMOA 的每珠平均酶 (AEB)。空白=不含目标蛋白的缓冲液。

多重ELISA

值得一提的是,IQELISA 和 SIMOA 分别可以同时分析多达 3 个和 6 个目标。除了需要更少的样品之外,在分析相同数量的蛋白质时,多重检测通常比单重检测更具成本效益。重要的是,多重检测会降低 IQELISA 的灵敏度,而使用SR-X TM生物标志物检测系统的SIMOA 则不会影响灵敏度

还提供其他定量多重 ELISA 选项,包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗体阵列Quantibody可以使用 100 µL 稀释样品在 6 小时内分析多达 40 种蛋白质,一式四份。使用兼容的激光扫描仪采集数据RayPlex可以使用流式细胞术在 4 小时内每次重复使用 25 µL 稀释样品测量多达 25 种蛋白质。两种抗体阵列的灵敏度与 sELISA 相似。

在我们的博客“使用抗体阵列进行多重蛋白质检测“或我们的视频“为您的研究识别正确的抗体阵列“中了解如何确定用于多重蛋白质检测的正确抗体阵列。

概括

标准 ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比较时具有优点和缺点:

  • sELISA是一种简单的比色测定法,数据易于解释,因此几乎不需要培训。使用能够测量 450 nm 吸光度的酶标仪在 5 小时内获得数据。使用比 IQELISA 和 SIMOA 试剂盒便宜的试剂盒可以靶向数千种不同的蛋白质。然而,与 IQELISA 和 SIMOA 相比,sELISA 的灵敏度低。

  • 免疫PCR使用实时PCR仪器,在6小时内收集数据。在此介绍的三个 ELISA 平台中,它的体积要求低,但比 sELISA 需要更多的移液和数据分析技术专业知识。平均而言,其灵敏度比 sELISA 高 23 倍。可以同时检测 3 种蛋白质,但检测灵敏度会降低。

  • SIMOA的灵敏度最高,其灵敏度平均分别比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要专门培训的昂贵专用仪器可在 3 小时内获得数据。它还需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的样本量。一次可以分析多达 6 种蛋白质,而不会影响灵敏度。

图 8 表明,对于许多蛋白质,LLOQ 的总体改进遵循以下趋势:SIMOA > IQELISA > sELISA。不过,也有例外。例如,IQELISA 对人 IL-1β 的灵敏度最高,为 0.0064 pg/ml,而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分别为 0.3 和 0.04 pg/ml。

ELISA、免疫 PCR 与 SIMOA:蛋白质检测工具的比较

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图 8. sELISA、免疫 PCR 和 SIMOA 之间灵敏度倍数增加的比较。 RayBiotech Life, Inc. 的每个靶标的相同标准品和抗体对用于所有平台。目标包括 28 种人类蛋白质、3 种小鼠蛋白质和 1 种大鼠蛋白质。(A) 17 种蛋白质的灵敏度提高了 0 – 100 倍;不包括(B)或(C)中的蛋白质。(B)九种蛋白质的敏感性增加了 0 – 1,000 倍;不包括(A)或(C)中的蛋白质。(C)两种蛋白质的敏感性增加了 0 – 10,000 倍;不包括(A)或(B)中的蛋白质。 Y 轴 = 与 X 轴下方描述的第二 ELISA 平台相比,第一个 ELISA 平台的灵敏度增加倍数。水平线=中位数。

结论

最常见的蛋白质检测工具之一是 ELISA。在这里,我们比较了三种流行的夹心 ELISA 平台:标准 ELISA免疫 PCR单分子阵列 (SIMOA)。在为研究选择合适的 ELISA 时,其底物、检测方法、仪器、样品量、灵敏度和成本是重要的考虑因素。标准 ELISA 是流行的方法,因为 可以使用低成本 试剂盒来靶向来自多个物种的数千种不同蛋白质。此外,它几乎不需要培训即可运行,其数据易于解释,并且使用非专用 酶标仪 与其他测定兼容。一个关键要点是 ELISA 灵敏度和成本之间需要权衡:灵敏度越高,成本越高。成本考虑了套件、培训、劳动力和所需仪器的价格。因此,sELISA 是实惠的选择,而 SIMOA 是最敏感的。

对于不具备必要的专业知识或设备来使用此处讨论的 ELISA 平台分析样品的实验室,RayBiotech Life, Inc. 提供完整的测试服务。该服务提供完整的报告,包括原始数据、标准曲线和定量数据。蛋白质浓度。

使用 dsGreen 染料进行 qPCR

使用 dsGreen 染料进行 qPCR

dsGreen 是一种非常灵敏的染料,用于检测双链 DNA (dsDNA)。两种染料均用于实时 qPCR 实验中扩增的非特异性检测。

  1. 如果 dsGreen 试剂储存温度低于 20 °С,请将其解冻并保存在室温下。为了快速解冻,可将试剂加热至 50 °С。

  2. 根据 PCR 试剂制造商的说明计算反应所需试剂的体积。请注意,dsGreen(库存 100х)必须在 PCR 主混合物中稀释至最高 1 倍浓度。

  3. 根据 PCR 试剂制造商的说明制备不含 DNA 的 1x 主混合物,添加必要量的 dsGreen。如果您使用不带热启动的 Taq 聚合酶,请将预混液和 PCR 管放在冰上。

  4. 将主混合物转移至管或板中并添加 DNA。

  5. 根据您的仪器制造商的说明继续进行放大。

笔记:

qPCR 实验中始终包含阳性和阴性对照。 qPCR 扩增的温度程序与给定模板和引物的标准 PCR 程序没有区别。对于检测,应使用 FAM 通道。为了能够区分特定产物和引物二聚体,请在 PCR 程序中使用熔解曲线步骤。

选购PCR仪要进行哪些方面的筛选

选购PCR仪要进行哪些方面的筛选

  PCR仪已经成为分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域广泛应用的一种实验室仪器。
  PCR扩增仪直接影响临床检测结果的准确性、重复性、甚至工作效率。PCR仪器品牌的选择,是首先关系到实验进行是否出现故障的重要因素,你知道选购PCR仪要进行哪些筛选吗?
  一、温度控制
  对普通PCR仪来说,温度控制主要是指温度的准确性、均匀性、以及升降温速度,对梯度PCR仪来说,除了温度的准确性和均匀性、升降温速度以外,还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。
  温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性,它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题,对于PCR反应而言最重要的莫过于温度控制的准确性,由于PCR是一个几何级数扩增的过程,扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果,不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度,对退火温度而言温控显的尤为重要,有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败,所谓差之毫厘,谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。
  温度的均匀性是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用同样的样品,同样的PCR反应程序,最后的结果竟然差异非常明显,或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔,就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论,PCR仪的温度均匀性不好,特别是最外周的样品孔情况更差,很有可能影响实验结果-即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响更为明显。
  温度控制除了精确度,还有一个厂家喜欢大力宣传的指针-升降温的速度。更快的升降温速度,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,能提高PCR反应特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温更快速的半导体。除了机械本身的原因,影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。
  二、仪器的功能性和人性化设计
  热盖:现在的PCR仪一般均配备热盖,热盖温度设为105℃,使样品管顶部的温度达到105℃左右,蒸发的反应液就不会产生凝集在管盖上而改变反应体积,这样用户就无需再向反应管内加石蜡油,直接减少后继操作的麻烦。如果是旋转加压的热盖就要特别小心,因为压力到达时没有明显的提示,用户需要根据经验将热盖旋到合适位置,不太容易掌握。如果过松,热盖没有充分接触反应管而影响结果;如果过紧,则会导致反应管变形,甚至可能造成热盖的机械故障。
  样品基座:PCR反应多在0.2或者0.5的管子中进行,多数PCR仪也配备了不同的可更换样品槽适配不同的样品管。
  软件:新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕,显示实时信息,倒计时,记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。

如何进行PCR基因扩增仪的维护保养工作

如何进行PCR基因扩增仪的维护保养工作

  PCR反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气,通常在反应管上加盖加热的盖子(比加热板温度来的高),或者在反应体系表面加入一层石蜡油。
  PCR基因扩增仪适用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反应为特征的、以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析。
  PCR基因扩增仪的日常维护保养工作:
  1、样品池的清洗
  先打开盖子,然后用95%乙醇或10%清洗液浸泡样品池5min,然后清洗被污染的孔;用微量移液器吸取液体,用棉签吸干剩余液体,设定保持温度为50℃的PCR程序并使之运行,让残余液体挥发去除,一般5~10min即可。
  2、热盖的清洗
  对于荧光定量基因扩增仪,当有荧光污染出现,而且这一污染并非来自样品池时,或当有污染或残迹物影响到热盖的松紧时,需要用压缩空气或纯水清洗垫盖底面,确保样品池的孔干净,无污物阻挡光路。
  3、仪器外表面的清洗
  清洗JS-G基因扩增仪的外表面可以除去灰尘和油脂,但达不到消毒的效果,选择没有腐蚀性的清洗剂对基因扩增仪的外表面进行清洗。
  4、更换保险丝
  先将基因扩增仪关机,拔去插头,打开电源插口旁边的保险盒,换上备用的保险丝,观察是否恢复正常。
  PCR基因扩增仪维护注意事项:
  1、注意本机的使用环境条件和电源;
  2、机盖开关要轻,以防损坏盖锁;
  3、严禁工作时打开机盖;
  4、定期用中性肥皂水清洗样品槽,严禁使用强碱、有机溶液和高浓度酒精擦洗;
  5、有故障时请有专业知识的维修人员或厂家技术人员维修。

PCR基因扩增仪的选购标准

PCR基因扩增仪的选购标准

  PCR基因扩增仪,即聚合酶链式反应仪器,是分子生物学实验中*精密设备。选购PCR基因扩增仪时,需要根据实验室的具体需求、预算、以及设备的技术参数和售后服务等多方面因素进行综合考虑。
  1. 需求分析:
  首先,明确实验室的主要研究方向和实验需求。不同的研究目的可能需要不同功能的PCR仪。例如,如果实验室主要进行常规的PCR检测,那么基本的热循环仪可能就足够了;如果需要进行定量PCR分析,那么就需要购买实时荧光定量PCR仪。此外,还需考虑样本通量、实验频率和预期的扩增体积等因素。
  2. 技术参数:
  选购PCR仪时,需要关注以下几个关键技术参数:
  - 温度范围和精度:PCR仪的温度范围通常应覆盖从低温到高温的范围,且温度控制精度需达到±0.1°C或更高。
  - 升降温速度:快速升降温可以缩短实验周期,提高效率。
  - 模块均匀性:模块间温度的一致性对于提高实验结果的重复性和可靠性至关重要。
  - 软件功能:用户友好的操作界面、灵活的程序设置、数据存储和导出功能等都是需要考虑的因素。
  - 容量和通量:根据实验需求选择合适的样品容量和通量,以适应不同的实验规模。
  3. 品牌和型号:
  市场上有多种品牌的PCR基因扩增仪,如Applied Biosystems、Bio-Rad、Eppendorf、Thermo Fisher Scientific等。每个品牌都有其特点和优势,可以根据实验室的偏好和经验选择。同时,也要考虑型号的新旧和技术的成熟度。
  4. 预算:
  PCR仪的价格从几千美元到几万美元不等,因此预算是选购时的一个重要因素。在预算允许的情况下,尽可能选择性价比高的型号。同时,也要考虑长期的耗材成本和维护费用。
  5. 售后服务:
  良好的售后服务可以保障设备的正常运行和维护。了解供应商的服务网络、维修响应时间和备件供应情况是非常重要的。此外,操作培训和技术支持也是选购时需要考虑的因素。
  6. 用户反馈:
  参考其他实验室或用户的使用反馈可以帮助了解特定型号的性能和可靠性。可以通过学术会议、论坛、产品评论等途径获取这些信息。
  7. 附件和升级:
  考虑未来可能的需求变化,选择可以升级或添加附件的PCR仪,以便在未来扩展功能或提高效率。