大鼠P27蛋白(P27)酶联免疫检测试剂盒说明书

大鼠P27蛋白(P27)酶联免疫检测试剂盒说明书

   用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中P27蛋白(P27)测定。

工作原理

本试剂盒采用的生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法ELISA)测定样品中大鼠P27蛋白(P27)水平。向预先包被了大鼠P27蛋白(P27)单克隆抗体的酶标孔中加入大鼠P27蛋白(P27),温育;温育后,加入生物素标记的抗P27蛋白(P27)抗体。再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠P27蛋白(P27)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1

1

封板膜

2片(48

2片(96

密封袋

1

1

酶标包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

标准品640pg/ml

0.5ml×1

0.5ml×1

2-8℃保存

标准品稀释液

3ml×1

6ml×1

2-8℃保存

链霉亲和素-HRP

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

生物素标记的抗P27抗体

0.5ml×1

1 ml×1

2-8℃保存

显色剂A

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

显色剂B

3 ml×1

6 ml×1

2-8℃保存

终止液

3ml×1

6ml×1

2-8℃保存

浓缩洗涤液

20ml×20倍)×1

20ml×30倍)×1

2-8℃保存

需要而未提供的试剂和器材

1. 37恒温箱。

2. 标准规格酶标仪。

3. 精密移液器及一次性吸头

4. 蒸馏水,

5. 一次性试管

6. 吸水纸

注意事项

1. 2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差

3. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

4. 免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜

5. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6. 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。

自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

2.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但避免反复冻融

操作程序

1. 标准品的稀释:(本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)

320pg/ml

5号标准品

120μl的原倍标准品加入120μl标准品稀释液

160pg/ml

4号标准品

120μl的5号标准品加入120μl标准品稀释液

80pg/ml

3号标准品

120μl的4号标准品加入120μl标准品稀释液

40pg/ml

2号标准品

120μl的3号标准品加入120μl标准品稀释液

20pg/ml

1号标准品

120μl的2号标准品加入120μl标准品稀释液

                                                                                                                                                                                                                          2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加样:1)空白孔,空白对照孔不加样品,生物素标记的抗P27抗体,链霉亲和素-HRP,只加显色剂A&B和终止液,其余各步操作相同2)标准品孔:加入标准品50ul,链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体,故不加);3)待测样品孔:加入样本40ul,然后各加入P27抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul,盖上封板膜,轻轻震荡混匀,37℃温育60分钟

4. 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6. 显色:每孔先加入显色剂A50ul,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

7. 终止:每孔加终止50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)

8. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值) 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

操作程序总结:

1.准备试剂,样品和标准品

2.加入准备好的样品和标准品,生物素标记的二抗和酶标试剂,37℃反应60分钟

3.洗板5次,加入显色液A、B,37℃显色15分钟

4.加入终止液

5.10分钟内读OD值

6.计算

试剂盒性能:

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。

2.批内与批间应分别小于9%和15%

检测范围:

检测范围:10pg/ml-320pg/ml

保存条件及有效期:

保存:2-8

有效期:6个月(2-8℃)。