凝集素在组织化学、ELISA 和蛋白质印迹中的应用

发表于2024年4月22日由上海金畔生物科技有限公司

组织化学:

1。石蜡切片染色程序:用二甲苯或其他清洗剂和分级酒精系列对组织切片进行脱蜡和水化，在自来水中冲洗5分钟。如果需要，检索抗原使用抗原揭膜溶液(柠檬酸盐为基础，Cat。不。H-3300或tris型，Cat。不。h – 3301)。1 b。冷冻切片染色程序:风干切片。染色前立即用丙酮固定切片。将片传输到缓冲区。如果内源性酶活性存在，用适当的方法灭活。

2. 如果需要，使用链亲和素/生物素阻断试剂盒(Cat)进行链亲和素/生物素阻断。不。sp – 2002)。Avidin/Biotin阻断试剂盒(Cat.;不。SP-2001)是一种含有末端甘露糖残基的糖蛋白。不建议使用亲和素/生物素阻断试剂盒，特别是当使用甘露糖特异性凝集素时。

3.用carbofree™阻断溶液(Cat)孵育片段阻断非特异性结合。不。SP-5040)在室温下放置30分钟。从切片上吸去多余的堵塞溶液。

4. 在PBS (10 mM磷酸钠，150 mM NaCl, pH 7.4)中加入约2-20 μg/ml的生物素化凝集素，在室温下孵育30分钟。用TPBS (PBS + 0.05% Tween®20)清洗。

5. 准备VECTASTAIN®Elite®ABC-HRP (Cat)。不。PK-6100)或VECTASTAIN®ABC-AP (Cat;不。根据试剂盒说明使用AK-5000)试剂。涂于切片上，室温孵育30分钟。用TPBS清洗。6. 为步骤5中使用的酶系统应用适当的沉淀底物。对于过氧化物酶，impact®DAB (Cat。不。SK-4105);用于碱性磷酸酶，impact®Vector®Red (Cat;不。推荐使用SK-5105)。用自来水冲洗。7. 防污(可选)，清洁和安装。

ELISA:

1。将50-200 μl约3 μg/ml的糖蛋白溶液放入所需孔中，将目标蛋白吸附到微滴板上。有些井可能不进行处理，作为负控制。37℃孵育1小时。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗涤孔3次。

2. 阻断非特异性结合，在室温下用无碳水化合物阻断溶液将每个孔填满30分钟。用TPBS洗三次井。在下面的程序中，试剂的体积为100 cm2膜的开发进行了优化。体积可以按比例调整不同大小的印迹。

3.在PBS中加入50-200 μl约2-20 μg/ml的生物素化凝集素，室温孵育30分钟。用TPBS洗三次井。

4. 根据试剂盒说明制备veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP试剂。涂于孔中，室温孵育30分钟。用TPBS洗三次井。

5. 为步骤4中使用的酶系统应用适当的非沉淀底物。对于过氧化物酶，TMB (Cat。不。推荐使用SK-4400)。6. 用分光光度法定量有色反应产物。

Western Blot:

1。根据标准程序进行电泳并将蛋白质转移到膜上。

2. 室温下，在无碳水化合物阻断溶液中培养30分钟，阻断非特异性结合。使用足够的体积来覆盖薄膜。

3.在含有约2-20 μg/ml生物素化凝集素的PBS中室温孵育膜30分钟。用TPBS (PBS + 0.05% Tween 20)洗涤。

4. 根据试剂盒说明制备veectastain Elite ABC-HRP或veectastain ABC-AP试剂。室温下将膜在试剂中孵育30分钟。用TPBS清洗。

5. 为步骤4中使用的酶系统应用适当的底物。对于过氧化物酶，DuoLuX®化学发光和荧光底物(过氧化物酶，Cat。不。SK-6604)或impact®DAB (Cat。不。sk – 4105)建议;碱性磷酸酶，化学发光和荧光底物(碱性磷酸酶，Cat。不。SK-6605)或BCIP/NBT(碱性磷酸酶，Cat。不。SK-5400)。仅供研究使用。不适用于动物或人类的治疗或诊断用途。

负控制:负控制应该在上述每种方法中并行运行，以验证绑定结果。当应用凝集素时，最合适的阴性对照之一是预先吸收凝集素与已知凝集素具有高亲和力的特定糖的浓度。Vector Laboratories提供了一系列用于这一目的的糖。将凝集素在含有约200 – 500mm糖的溶液中稀释到合适的工作浓度。该混合物在室温下结合30至60分钟。在吸收孵育之后，将混合物替换为未吸收的凝集素，并在相同条件下孵育。测试方法遵循后续检测程序。在大多数情况下，绝大多数凝集素结合到组织切片(膜印迹等)将被消除。在这些条件下，一些与切片的痕量结合(印迹等)可能仍然存在，并且可能表明存在二级或三级糖偏好。这些阴性对照结果应与试验结果进行比较，以确定结合的特异性。

hellobio免疫组织化学 (IHC) 实验组织准备

发表于2024年4月19日由上海金畔生物科技有限公司

hellobio免疫组织化学 (IHC) 实验组织准备

高质量的组织制备对于高质量的免疫组织化学结果绝对必要，因此始终值得花时间确保按照尽可能高的标准进行，以避免令人失望的结果。根据实验要求，组织可能需要新鲜使用或固定。

1 冷冻组织以供后续处理

有时需要在进一步处理或随后的固定之前冷冻组织。如果冷冻不当，可能会形成冰晶，损害细胞结构。通过正确冷冻，这将保持组织的质量，从而最大限度地提高免疫染色成功的机会。

1. 将装有异戊烷的烧杯（长烧杯中至少 500ml）在 -80°C 中或使用干冰预冷至 -42°C 至 -45°C 之间。定期监测温度以确保温度保持在这个范围内。

2. 在冰上使用干净的工具解剖组织。

3. 将纸巾放在铝箔上，并用滤纸除去多余的液体。

4. 将组织（不含铝箔）轻轻浸入异戊烷中。冷冻所需时间取决于组织样本大小，但冷冻成年大鼠大脑大约需要 5 分钟。

5. 在从异戊烷中取出组织之前，预冷镊子。将冷冻组织放入装有软纸巾的预冷管中。

6. 储存于-80°C 直至下次使用。

2 灌注固定

一般来说，当动物被灌注固定时，可以获得最佳质量的组织切片。该过程涉及先用缓冲液然后用固定剂替换血液，并且其具有高自发荧光。在尝试之前，请确保您的监管制度涵盖了这一点，并获得经验丰富的从业人员的培训。针对啮齿类动物的一般方案是：

1. 通过适当途径过量注射麻醉剂，直至动物没有脚趾捏和眨眼反射但心脏仍在跳动。

2. 打开胸腔，露出心脏，剪断右心房。将针插入左心室，并通过冰冷的 PBS（大鼠约 200ml，小鼠约 15ml）灌注，然后灌注类似体积的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。

3. 取出大脑/其他器官，放入装有 4% 多聚甲醛的小瓶中，在 4°C 下放置 24 小时。

4. 将组织移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至组织沉入小瓶底部

3 浸入固定

对于小体积的组织，通常用固定剂孵育组织就足够了，而不是使用灌注固定。然而，这将导致较高的背景，因为血液不会从小毛细血管中去除。

1. 在冰上用干净的工具解剖组织。

2. 用冰冷的 PBS 短暂清洗

3. 将组织放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中，4°C 下放置 24 小时

4. 将组织移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至组织沉入小瓶底部

4 切片

可以在一系列机器上切割切片，最常见的是低温恒温器和冷冻切片机。机器的选择部分取决于可用性，部分取决于需要切割多厚的部分。检查可用机器的规格是否与所需的截面厚度相匹配。

对于载玻片免疫组织化学，切片可以直接切割到显微镜载玻片上，或者切割到 PBS 中，用于自由浮动免疫组织化学。

切割后，切片可以冷冻以供日后处理：

载玻片安装：让切片干燥后，切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存长达一年
自由浮动将切片转移至冷冻保护剂中，然后在 -20°C 下保存长达一年。

免疫组织化学 (IHC) 故障排除

发表于2024年4月19日由上海金畔生物科技有限公司

免疫组织化学 (IHC) 故障排除

免疫组织化学是一个漫长的多步骤过程，可能会出现很多问题，并且实验成功需要考虑很多因素。在某些时候，不可避免地会出现问题或不是最佳状态。下面汇总了一些可能导致免疫组织化学结果欠佳的最常见陷阱。

问题	潜在原因	建议的解决方案
弱染色或无染色	抗体浓度过低	尝试增加一抗浓度考虑使用使用生物素化二抗的扩增系统
	抗体不相容性	确保二抗与一抗的物种和抗体亚类兼容
	高背景会模糊信号	请尝试遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特异性染色”部分中详细介绍的建议。
	膜被透化试剂损坏	尝试使用较低浓度的清洁剂。尝试使用较弱的清洁剂（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）
	抗体不适合 IHC	有些抗体不适合 IHC 中抗原的呈现方式。检查数据表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中进行过测试，如果没有，请考虑使用不同的抗体。尝试使用不同的固定方法，该方法将以不同的方式呈现抗原，因此可能允许抗体结合。
	目标蛋白丰度低	尝试增加一抗浓度尝试使用放大方法，例如生物素化二抗
	固定可能会掩盖目标表位	尝试第 5.2 节中描述的抗原修复方法之一
	抗体对组织切片的渗透性较差	尝试将抗体孵育更长时间或以更高的浓度尝试使用更薄的组织切片尝试使用较小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）
	通透性不足	尝试增加缓冲液中 Triton-X100 的浓度。如果使用 Tween-20，请考虑改用 Triton-X100，这是一种更强的清洁剂。
	与检测系统使用不兼容的二级荧光团	仔细检查所使用的显微镜系统是否具有适合所使用荧光团的正确激发和发射滤光片。考虑使用不同的荧光团偶联二抗。几乎所有荧光显微镜至少都配备滤光片组，能够对 DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 进行成像。
	安装后荧光团降解	免疫荧光切片封片后 2 天内对切片进行成像。
	缓冲区退化	使用前检查缓冲液的 pH 值警惕细菌生长的迹象，一旦发现就扔掉。必要时新鲜制作。
	降解的一抗	确保抗体在制造商提供的最佳使用日期内。考虑将来分装抗体，快速冷冻，然后储存在 -80°C 下，以避免抗体降解的风险。
	由于光漂白而损坏荧光团共轭二抗		确保使用荧光团共轭二抗时执行的所有步骤都是在弱光或黑暗中进行成像时尽量使用尽可能低的照明来捕获最佳图像。这对于共焦显微镜尤其重要，因为高激光功率设置可以极快地漂白一些荧光团。考虑使用比 FITC 或 TRITC 等旧化合物更耐漂白的荧光团。
	不兼容的缓冲区		一些抗体在基于 TBS 的缓冲液中表现更好，而其他抗体则更喜欢 PBS。尝试更换缓冲液，看看这是否会增加染色。
	过度固视		尝试减少组织与固定剂一起孵育的时间。考虑尝试替代固定液
多路复用时在通道之间渗透	重叠的荧光团激发/发射光谱		尝试使用重叠有限的荧光团对（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）使用光谱分析工具（例如FPbase Spectraviewer）确保荧光团对之间的重叠有限。尝试使用单一抗体对照，看看一个通道中的信号是真实的还是只是由于渗漏所致。一些先进的图像分析软件具有可以（在一定程度上）校正渗色的功能。
	成像系统上的激发和发射滤光片不合适		检查荧光团和滤光片之间的兼容性，以确保每个滤光片仅捕获荧光团。对于共焦显微镜，请考虑收紧允许进入检测器的光波长窗口并使用测序，以便每个荧光团只有一个激光处于活动状态。
组织形态改变	冰伤害		确保在未来的实验中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷冻组织。将组织切片放入 30% 蔗糖中时，确保组织已全沉没，否则蔗糖可能没有足够的时间扩散到组织中。考虑在分析中引入损伤评分系统，以评估冰损伤是否影响实验结果。
	自由浮动部分的粗暴处理		使用网等设备可以帮助减少整个协议中组织切片所需的处理量。使用优质细画笔拾取和移动部分。确保没有被低温恒温器/切片机刀片降解。安装自由浮动部分时，尽量避免接触部分，而是使用刷子飘到载玻片上。
	因储存不当而降解		如果保存不当，切片可能会被微生物生长污染。考虑使用 0.05% 叠氮hua钠来防止储存溶液或冷冻切片中的生长
	抗原修复过于苛刻		考虑将抗原修复方法改为不太苛刻的方法
	冰冻切片从载玻片上脱落		确保始终对载玻片进行处理，以确保切片更有效地粘贴。虽然有商业品种，但可以按照CSH 协议等既定协议在实验室中对载玻片进行替换；
	固定不佳		不全固定会导致组织迅速降解。尝试增加组织与固定剂一起孵育的时间或考虑增加固定剂的浓度。
高背景或非特异性染色	组织切片中的自荧光分子		如果组织尚未灌注，请考虑在下一个实验中进行，因为剩余的红细胞会产生强烈的自发荧光。自发荧光可能是由固定剂引起的。尝试使用不同的固定剂。确保 NaBH 4是新鲜制备的尝试用淬灭荧光的染料（例如，Pontamine 天蓝、苏丹黑或台盼蓝）孵育切片。尝试使用与自发荧光波长不同的荧光团（例如红移染料，如 Alexa Fluor 680）
	非特异性二次结合		运行无初级对照以评估次级对照是否与组织切片结合。如果一抗与组织来自同一物种，这可能会导致重大问题。请参阅本协议或考虑使用不同种类的一抗。
	一抗浓度过高		尝试降低一抗浓度
	二抗浓度过高		尝试降低二抗的浓度。我们发现 1:300 至 1:500 的稀释度是一个不错的起点。
	抗体纯化不充分		未纯化的多克隆抗体可能含有与一系列非靶蛋白发生交叉反应的抗体。检查数据表；理想情况下，应使用免疫原作为诱饵，通过亲和层析纯化多克隆抗体。虽然单克隆抗体的问题较少见，但仍应至少使用 Protein A 或 G 亲和层析进行纯化。如果有其他替代品，请考虑改用更好的纯化抗体，或者如果没有其他替代品，请考虑内部纯化抗体。
	阻挡不足		确保封闭血清与培养二抗的物种相同。尝试使用不同的阻塞解决方案。尝试增加封闭步骤的长度或增加血清浓度
	洗涤不足		尝试增加洗涤的时间和/或次数。确保洗涤期间有足够的搅拌，以帮助未结合的抗体扩散出组织
	一抗与组织切片来自同一物种。		运行无初级对照以评估次级对照是否与组织切片结合。如果一抗与组织来自同一物种，这可能会导致重大问题。请参阅本协议第 4.3 节或考虑使用不同种类的一抗。
	内源酶活性（用于显色检测）		尝试用特定抑制剂阻断内源酶活性。对于 HRP 结合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分钟。如果在此浓度下封闭不成功，请考虑增加至 3%。对于 AP 结合二抗，请使用 2mM 左旋咪唑。
	部分已经干了		确保切片始终保持湿润，并在加湿室中使用载玻片安装方案进行长时间孵育。
	底物过多（用于显色检测）		尝试降低底物浓度或孵育时间。
	信号放大率过高（如果使用生物素化二抗）		尝试降低扩增试剂或二抗的浓度。考虑信号放大是否必要或者标准方法是否有效。
	组织切片厚度		组织切片越厚，宽视野显微镜中的散射光越多。尝试使用更薄的开关部分或共焦显微镜。

免疫组织化学 (IHC) – 实验方案

发表于2024年4月12日由上海金畔生物科技有限公司

免疫组织化学 (IHC) – 实验方案

免疫组织化学是免疫染色在组织学中的重要应用。它需要使用与生物组织中的这些抗原结合的抗体来特异性检测细胞中的抗原。组织样本通过石蜡包埋或福尔马林固定方法固定，并用抗原修复剂进行预处理。预处理对于通过破坏福尔马林诱导的抗原交联来改善抗原的表达至关重要。然后封闭载玻片以减少背景，并可以通过直接标记或间接测定进行染色。

免疫组织化学 (IHC) – 实验方案

脱蜡

将载玻片在 60°C 孵育 60 分钟。

在二甲苯中脱蜡 10 分钟，然后再重复一次。

在 100% 酒精中水合 5 分钟，然后在 95% 酒精中水合 5 分钟，然后在 85% 酒精中水合 5 分钟，然后在 75% 酒精中水合 5 分钟。

浸入蒸馏水中5分钟

浸入 TBS（50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6）中，放置 5 分钟，然后重复两次。

抗原修复

将 500-2000 ml 10 mM 柠檬酸盐缓冲液 (pH6.0) 在不锈钢高压锅中煮沸。

将载玻片放入染色架中，然后放入高压锅中，确保载玻片充分浸入柠檬酸盐缓冲液中。

3-4 分钟后，当压力指示阀上升时，孵育 1 分钟。

将载玻片自然冷却至室温。

浸入蒸馏水中，放置 5 分钟，重复两次。

将载玻片浸入 TBS 中 5 分钟，然后重复两次。

在室温下将载玻片浸入 3% H2O2（新鲜甲醇中）15 分钟。

用蒸馏水清洗两次，每次5分钟。

用TBS（pH 7.6）洗涤两次，每次5分钟。

一抗染色

用 TBS 中的 3% BSA 稀释一抗。用稀释的一抗覆盖载玻片上的组织切片（每张载玻片使用 50-150 μl）。

37℃孵育30分钟或室温60分钟（最佳孵育时间、孵育温度和抗体稀释度应由各个实验室确定）。

用TBS洗涤两次，每次5分钟。

二抗染色

与 100-200μl 聚合物增强剂一起孵育 37C 孵育 30 分钟

用TBS洗涤3次，每次5分钟。

与 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育，并在 37C 下孵育 30 分钟

用TBS洗涤3次，每次5分钟。

加入dAb溶液，孵育3-10分钟（反应进度和最佳时间应根据显微镜确定）。

用蒸馏水清洗2次，每次5分钟。

如果需要，用苏木精复染切片，用蒸馏水清洗。将玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒，用蒸馏水清洗。

95%乙醇脱水1分钟，100%乙醇脱水2×3分钟，二甲苯脱水2×3分钟，盖玻片封固剂。

bioenno 复染套件Cat#003102

发表于2024年4月1日由上海金畔生物科技有限公司

bioenno 复染套件

简要描述：复染试剂盒专门设计用于对已完成酶组织化学、免疫组织化学、原位杂交或高尔基体染色的脑切片进行复染。bioenno 复染套件

详细介绍

产品咨询

品牌	其他品牌	货号	Cat#003102
供货周期	一个月	应用领域	医疗卫生,化工,生物产业,制药

bioenno 复染套件

复染试剂盒专门设计用于对已完成酶组织化学、免疫组织化学、原位杂交或高尔基体染色的脑切片进行复染。它还适用于常规组织学切片，包括冷冻和石蜡包埋的组织切片以及培养细胞。该套件提供 3 种复染溶液（红色、绿色和紫蓝色），可直接从滴管瓶中使用。这些染料溶液的配方使研究人员能够以较低的背景对细胞元素进行可靠、最特异的染色。

bioenno 复染套件Cat#003102

(A) 用甲酚紫溶液复染切片。免疫反应产物（棕色）首先使用 Bioenno DAB 试剂盒开发。 (B) DAB-Co 试剂盒用于培养免疫反应性神经元（蓝黑色），然后进行中性红复染。 (C) 甲基绿复染。棕色浦肯野细胞使用 DAB 试剂盒进行培养。 (D) DAB 和 BDHC 试剂盒均用于呈现双标记（分别为棕色和蓝色），然后进行甲酚紫复染。 (E,F) Bioenno superGolgi 试剂盒用于对树突棘进行染色（切片厚度为 150 µm），然后进行甲酚紫 (E) 和中性红 (F) 复染。所有图像均取自成年小鼠的大脑。

试剂盒提供的试剂：

甲酚紫：30 毫升溶液装在滴管瓶中。该溶液配制用于对神经元细胞质中的尼氏体进行染色。尼氏物质（粗面内质网）将被染成紫蓝色。
甲基绿：30 ml 溶液装在滴管瓶中。甲基绿是一种核复染剂，可将细胞核染成浅绿色。该溶液已用氯仿纯化。
中性红：30 毫升溶液装在滴管瓶中。该溶液可用作各种组织学程序中的红色核复染剂。
醋酸乙醇：30 ml 分化溶液装在滴管瓶中。大多数情况下不需要区分染色。然而，在此溶液中孵育切片可能有助于消除非特异性背景染色。该溶液含有70%乙醇和0.02%乙酸。

使用说明：

(A) 完成免疫组织化学 (IHC/ICC)、原位杂交 (ISH) 或高尔基体染色的切片：

完成 IHC/ICC、ISH 或高尔基体染色，并将组织切片安装在粘性显微镜载玻片上。在室温（RT，18-25°C）下风干载玻片。
在 0.01 M PBS-T 中清洗干燥载玻片 1-5 分钟，然后在 dH2O 中冲洗 1-3 秒。
将载玻片放在水平表面上，然后将一种复染溶液涂抹到切片上。确保这些部分全被溶液覆盖。根据所需的强度和组织类型，在 RT 下孵育切片 1-5 分钟。孵育后，用 dH2O 洗掉多余的复染溶液。

在显微镜下检查染色切片以获得最佳结果。
最佳时间应由研究者确定。某些特定组织可能需要更长的孵育时间。

如果需要，区分试剂盒中提供酸性乙醇或 70% 乙醇几秒到几分钟的切片，并在显微镜下检查以获得最佳结果。用 dH2O 洗掉乙醇。

细胞成分和背景的染色强度在酸性乙醇或70%乙醇中快速降低。
如果染色较浅，只需重新涂抹复染溶液并再次孵育切片即可。

将载玻片风干，然后直接在 100% 乙醇中脱水切片 1-2 次，每次 3-5 分钟。在二甲苯或二甲苯替代品中透明，更换2-3次，每次3-5分钟。使用 Permount® 封固剂盖玻片。

对于较厚的高尔基体染色切片，可能需要更长的脱水和透明时间。

(B) 常规组织学切片：

切片应安装在明胶包被的或带正电的载玻片上。石蜡包埋切片在染色前应脱蜡。

风干切片/载玻片。在 0.01 M PBS-T 中清洗载玻片 1-5 分钟，然后在 dH 2 O 中冲洗 1-3 秒。

如上所述，在一种复染溶液中染色 1-5 分钟。

如果需要，可在酸性乙醇或 70% 乙醇中分化几秒至几分钟，并在显微镜下检查以获得最佳结果。

在 100% 乙醇中脱水，在二甲苯或二甲苯替代品中澄清，并用如上所述的非水封固剂盖玻片。

储存、安全和操作注意事项：

将套件存放在 2-25°C 下，并避免强直射光。
该试剂盒仅供体外研究使用，不适用于药物、诊断或其他用途。
该试剂盒含有与皮肤接触、吸入或摄入可能有害的试剂。请勿用嘴移液。使用普通预防措施避免吸入以及接触皮肤和眼睛。如果接触，请立即用大量水清洗并就医。如果吞咽，请用水漱口并立即就医。
在化学罩下进行实验。处理试剂盒试剂时，请穿戴合适的防护服、手套和眼睛/面部防护装置。进行实验后洗手。
可根据要求提供材料安全数据表 (MSDS)。

bioenno 复染套件

上海金畔生物科技有限公司

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标签归档：组织化学

凝集素在组织化学、ELISA 和蛋白质印迹中的应用

hellobio免疫组织化学 (IHC) 实验组织准备

1 冷冻组织以供后续处理

2 灌注固定

3 浸入固定

4 切片

免疫组织化学 (IHC) 故障排除

免疫组织化学 (IHC) – 实验方案

bioenno 复染套件Cat#003102

bioenno 复染套件

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