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可电离脂质的应用——RNA 递送

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可电离脂质的应用——RNA 递送

可电离脂质是一类有机脂质分子，在生理 pH 值下呈中性，在酸性 pH 值下呈质子化 (+)。可电离的脂质与磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质一起构成脂质纳米颗粒 (LNP) 的结构。

可电离脂质在 LNP 中发挥作用，可保护 RNA 免受水解、核酸酶、pH 突然变化和氧化损伤的降解，以促进其胞质转运（图 1）。本质上，可电离脂质有助于促进 RNA 递送至靶细胞。

可电离脂质的应用——RNA 递送

图 1：LNP 复合物中的可电离脂质发挥作用，促进 mRNA 胞质转运至靶细胞中。

从结构上看，目前有五种主要的可电离脂质类型广泛用于 RNA 递送；不饱和、多尾、聚合、可生物降解和支化尾（表 1）。

不饱和可电离脂质通过增加双层脂质形成非双层相的倾向来增强膜破坏，以及随后的有效负载释放。双层脂质的这种转变趋势是尾部饱和度从 0 个顺式双键增加到 2 个顺式双键的结果。例如，MC3（表 1，第 1 行）的每个尾部都有两个顺式双键，MC3证明了不饱和可电离脂质能够增强 LNP 将 RNA 递送至靶细胞的能力，从而重新点燃了治疗学中 RNA 递送的热情，特别是 mRNA 疫苗。

多尾可电离脂质通过产生增加尾部区域横截面积的锥形 LNP 结构来增强内体破坏以及随后的 RNA 递送。因此，在使用此类脂质的同时优化 LNP 结构可以提高 RNA 效力。例如，C12-200（表 1，第 2 行）是一种多尾离子化脂质，与标准制剂相比，mRNA 表达量增加了 7 倍。这种使用多尾可电离脂质的优化配方被用于各种 mRNA 递送目的，特别是产前蛋白质替代疗法。

聚合可电离脂质通过疏水聚集增强颗粒形成，从而增强 RNA 递送。这种通过疏水聚集的增强是通过将游离胺取代到具有烷基尾部的阳离子聚合物上来实现的。例如，G0-C14（表 1，第 3 行）通过赋予肿瘤中各种 RNA 治疗剂的高积累/效力和有效转染，证明了 LNP 在癌症治疗中的前景。

可电离脂质的应用——RNA 递送

可生物降解的电离脂质可减少细胞内 RNA 成功递送后的持续积累和毒性。这对于需要重复给药的 RNA 疗法尤其重要。这种降低的毒性是通过包含酯键来实现的，因为它们在生理pH下稳定，但在组织和细胞内会水解。例如，L319（表 1，第 4 行）是通过用酯键替换每个MC3尾部中的一个双键而制成的。这保持了 RNA 有效负载的效力，同时显示出宿主更好的耐受性。

支尾可电离脂质通过增强内体逃逸和增加脂质尾部的横截面积来增加 RNA 递送效力。由于 RNA 递送的多方面增强，支尾可电离脂质可有效递送大型 mRNA 构建体，用于蛋白质补充和碱基编辑疗法等。例如，FTT5（表 1，第 5 行）展示了具有酯链的支尾可电离脂质如何比其线性类似物具有更高的转染效率。与直链尾巴相比，支链尾巴的这种较高效率可能是由于支链可电离脂质上存在的仲酯的降解速率较慢。

作为脂质供应商，BroadPharm提供多种可电离脂质，例如ALC-0315类似物、SM-102类似物、MC3、C12-200等，为我们的客户在纳米颗粒药物输送方面的高级研究提供支持。

什么是可电离脂质？

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什么是可电离脂质？

可电离脂质是一类脂质分子，在生理 pH 值下保持中性，但在低 pH 值下质子化，使它们带正电荷，ALC-0315（图 1）是一个例子，其胺位点可在低 pH 值下质子化。


图1： ALC-0315的结构


什么是可电离脂质？

可电离脂质是可电离脂质纳米颗粒 (LNP) 的关键成分之一，已广泛用于 RNA 治疗药物的全身递送。LNPs中的其他脂质分子包括辅助脂质、胆固醇、PEG脂质等。


LNP 制剂中常见的可电离脂质材料包括 C12-200、cKK-E12 和 DLin-MC3-DMA。这些 LNP 在 0.002 mg siRNA/kg 的剂量水平下在肝脏中显示出有效的基因沉默。


为什么使用可电离脂质？

可电离脂质的 pH 敏感性有利于体内 mRNA 的传递，因为中性脂质与血细胞阴离子膜的相互作用较少，从而提高了脂质纳米颗粒的生物相容性。被捕获在内体中，其中的pH值低于细胞外环境的pH值，可电离的脂质被质子化并带正电，这可能促进膜不稳定并促进纳米颗粒的内体逃逸。可电离脂质促进内体逃逸并降低脂质纳米颗粒 (LNP) 的毒性。


脂质供应商和客户综合

作为生化供应商，BroadPharm为全球客户提供各种脂质分子，例如可电离脂质、阳离子脂质、辅助脂质、PEG 脂质。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

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酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

随着反相快速色谱法在反应混合物纯化中的使用增加，出现了很多问题，因为许多化学家不像正相或硅胶柱色谱法那样熟悉这项技术。化学家提出的问题之一是关于 pH 调节剂（特别是酸）的使用及其纯化。

在反相占主导地位的 HPLC 领域，通常使用酸（甲酸、乙酸等），通常浓度为 0.1%。其基本原理是，如果样品成分在溶液中可电离，则其色谱保留和峰形可能会受到影响，并且其定量也会受到挑战。

电离/可电离化合物在溶液中时在带电状态和中性状态之间保持平衡。这些分子在中性溶剂系统中进行色谱分析时，可以显示为前峰（想想滑雪坡），因为电离部分比中性状态更易溶于水，因此洗脱得更快。添加 pH 调节剂，无论是酸还是碱，都可以迫使平衡全进入中性状态或进入电离状态。当全电离时，化合物会提前洗脱；当中性时，该化合物更具疏水性，并且其在柱上的保留增强。

例如，我们来看看通过琥珀酸酐和 α-甲基苄胺的微波反应生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亚胺的纯化，如图 1 所示。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反应器进行琥珀酸酐与 α-甲基苄胺的反应

当使用中性溶剂纯化时，产品前沿很差，表明它处于电离态和中性态之间的平衡，图 2。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 2. 使用中性水和乙腈的反应混合物反相快速色谱显示前沿产物峰。

产品作为非高斯前沿峰洗脱的问题是，它是一个宽广的峰，并且收集在多个柱体积 (CV) 中。这意味着收集的产物被稀释在比典型或期望更多的溶剂中，这增加了蒸发馏分溶剂的体积和时间，并增加了较低纯度和回收率的可能性。事实上，该反应混合物中存在较早洗脱的副产物，其污染了早期产物级分。是的，这些馏分可以被丢弃，但这会降低回收的产品产量，这不一定是理想的解决方案。

通过将酸（在本例中为0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中，可电离的反应混合物组分质子化。质子化产物的洗脱带减少（锐化），从而增加了其浓度以及与污染副产物的分离，图 3。副产物也质子化，导致其比中性流动相更早洗脱。结果是大大改善了分离，产物以更集中的谱带洗脱，并且与副产物的分离度更高。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 3. 使用酸化溶剂系统纯化反应混合物，使产物峰尖锐并降低干扰副产物的保留。

然而，化学家在使用 pH 值修改的流动相时需要小心，因为潜在的化合物保留随 pH 值变化而变化。在前面的例子中，电离化合物移动是有帮助的，但质子化化合物并不总是朝着有利的方向移动。当 pH 值发生变化时，洗脱的化合物可能会相互靠近甚至共洗脱。

我们可以看到这种情况发生在由靛红酸酐和 α-甲基苄胺微波反应生成的合成产物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，图 4。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 4. 靛红酸酐与 α-甲基苄胺的微波反应

当使用中性水/甲醇梯度纯化时，我们可以看到一些极性副产物在产品之前洗脱，以及强烈保留的副产物在产品后面以 9.5 至 14 CV 之间的宽峰形式洗脱，图 6。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 6. 反应混合物的 pH 中性反相快速色谱

在两种洗脱溶剂中添加 0.2% 冰醋酸后，洗脱化合物的保留率发生显着变化。副产物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脱，在酸性条件下离子化并以 1.5 CV 洗脱。尾随的疏水性副产物也电离并移近产物，图 7。

酸性 pH 调节剂如何影响快速色谱？

图 7. 使用酸化水/甲醇梯度纯化反应混合物，改变了两种副产物的保留。

随着产物和尾随副产物之间分辨率的降低，该反应纯化的负载能力降低，这意味着需要更大的柱（和更多的溶剂）来充分纯化反应产物。

因此，虽然流动相 pH 值调整有助于改善纯化，但请注意，洗脱体积和选择性可能会发生变化，从而可能降低纯化效率。

用于创建此数据的设备包括：

    • Biotage®引发剂+微波反应器

  • Biotage® Selekt Single 快速色谱系统

  • Biotage® Sphere C18 色谱柱，12 克

为什么 pH 调整对于样品制备方法很重要？

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为什么 pH 调整对于样品制备方法很重要？

酸解离常数 (pKa) 如何影响样品制备方法的开发？了解和了解化合物的 pKa 可以告诉您该化合物是否可以电离以及在什么条件下电离，因此您可以利用此特性来开发更好的样品制备方法。

酸解离常数pKa 是分析物 50% 离子化和 50% 非离子化时的 pH 值。图 1 显示了 pKa 为 8 的酸和碱在 pH 范围内的电离。对于酸，当 pH 值升高到高于其 pKa 时，分析物会电离；而当 pH 值降低到低于其 pKa 时，分析物不会电离。电离或非电离发生在 pKa 上方或下方 2 个单位处。对于碱，化合物在高于 pKa 时非电离，在低于 pKa 时电离。

当我需要开发新的样品提取方法时，我会查找测定中分析物的logP和 pKa，并考虑可能的干扰化合物。

为什么 pH 调整对于样品制备方法很重要？图 1. pH 对 pKa 为 8 的酸和碱电离的影响。

如果感兴趣的化合物可以电离，则可以使用强阳离子或阴离子    交换 SPE 以保留您的化合物。这些产品通常是键合二氧化硅或具有强阳离子交换（通常是磺酸根）或阴离子交换（通常是季铵）基团的聚合物相，如离子交换 HPLC 柱。由于任一样品制备柱的主链都是反相键合硅胶或聚合物，因此它们也具有反相特性，因此可以使用单个 SPE 柱进行离子交换或反相保留。这就是术语“混合模式 SPE”的由来。离子交换是一种非常强大的保留机制。带负电荷高于其 pKa 的酸性化合物可以承受高 pH 水洗和强有机洗涤，然后用酸化（通常使用甲酸或乙酸）洗脱溶剂进行洗脱。带正电荷低于其 pKa 的碱性化合物可以耐受酸性洗涤、强有机洗涤，并用添加碱（通常是氢氧化铵）的有机溶液洗脱。

对于含有酸性、碱性和中性化合物的大型尿液药物组，单次测定，混合模式聚合物反相强离子交换 SPE 可能是您的选择。如果您可以用酸（对于碱）或碱（对于酸性化合物）处理样品并将其离子化，则可以通过离子交换保留离子化的分析物，并通过反相保留非离子化的化合物。大多数药物都是碱性的，因此电离碱性药物并通过反相保留中性和酸性是一种常见的策略。使用这些方法时必须小心有机洗涤，因为反相保留的非离子化化合物可能会在强有机洗涤中被洗脱。您需要知道化合物的 logP 和 pKa，这样您就知道哪些化合物被反相保留，哪些化合物被离子交换保留，以及反相机制保留非离子化化合物的强度。根据离子交换机制（阴离子交换为酸性，阳离子交换为碱性），用酸性或碱性有机溶剂完成洗脱。有机溶剂还洗脱反相保留的化合物。选择正确的有机溶剂进行洗涤和洗脱对于优化样品清洁度非常重要。对于此类具有不同性质和保留特性的大量化合物的方法来说，样品清洁度和某些分析物的回收率会受到影响。有机溶剂还洗脱反相保留的化合物。选择正确的有机溶剂进行洗涤和洗脱对于优化样品清洁度非常重要。对于此类具有不同性质和保留特性的大量化合物的方法来说，样品清洁度和某些分析物的回收率会受到影响。有机溶剂还洗脱反相保留的化合物。选择正确的有机溶剂进行洗涤和洗脱对于优化样品清洁度非常重要。对于此类具有不同性质和保留特性的大量化合物的方法来说，样品清洁度和某些分析物的回收率会受到影响。