JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10线粒体膜电位检测试剂盒

货号： JP3207-100T 品牌： Jinpan 标签： 细胞生物学研究

描述

JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

JC-10线粒体膜电位检测试剂盒

温馨提示：见我司整理线粒体荧光探针产品专题。

产品标签

Rhodamine 123罗丹明123；JC-1；JC-10；CCCP；CAS：62669-70-9

订购信息：进口品质，现货供应。欢迎来电咨询，电话：021-50837765，18121428569；QQ：3308240863，2971634497。

产品描述

JC-10线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一种以JC-10为荧光探针，快速且灵敏的检测细胞、组织或纯化线粒体膜电位变化的试剂盒。因线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。因此本试剂盒可用于早期的细胞凋亡检测。

JC-10是一种新型的用来监测线粒体膜电位变化的荧光探针，是JC-1的优越替代物。与JC-1相比，具有以下几个重要优势：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明显降低；2）使用更方便——简化步骤将手动操作时间最小化；3）荧光信号更高——改良的信号与背景荧光的信噪比；4）结果更稳定——优化探针以保证更连续性和稳定性结果。

JC-10是一种替换JC-1，用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。JC-10以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。正常线粒体内，JC-10聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-10只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。

本试剂盒提供CCCP用作线粒体膜电位丧失的阳性对照。对于六孔板样品，本试剂盒可检测100个样品。

产品包装

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） JC-10（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2） 装载完JC-10后用JC-10染色缓冲液（1×）洗涤时，使JC-10染色缓冲液（1×）保持4℃左右，此时洗涤效果较好。

3） JC-10探针装载完并洗涤后尽量在30min内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

4） 请勿把JC-10染色缓冲液（5×）全部配制成JC-10染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-10染色缓冲液（5×）。

5） 如果发现JC-10染色缓冲液（5×）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，可在37℃加热促进溶解。

6） CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

7） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. JC-10染色工作液制备

对于六孔板，每孔所需 JC-10 染色工作液的量为1ml，其他培养器皿的JC-10染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50～100万细胞需0.5mL JC-10染色工作液。

取适量JC-10（200×），按照每50μL JC-10（200×）加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-10。然后再加入2mL JC-10 染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-10染色工作液。

【注意】：必须先把JC-10（200×）用超纯水（试剂盒提供）充分溶解混匀后，才可加入JC-10染色缓冲液（5×）。不可先配制JC-10染色缓冲液（1×）再加入JC-10（200×），这样JC-10会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。

2. 阳性对照的设置

CCCP（10mM）推荐按1∶1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20min。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。

对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20 min后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-10 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-10 染色后应显示绿橙色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3. 对于悬浮细胞

1） 取10～60万细胞，重悬于0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

2） 加入0.5mL JC-10 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期间，按照每1mL JC-10 染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-10 染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

4） 37℃孵育结束后，600×g4℃离心3～4min沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

5） 用JC-10 染色缓冲液（1×）洗涤2 次：加入1mL JC-10 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600×g4℃离心3～4min沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-10 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600×g4℃离心3～4min沉淀细胞，弃上清。

6） 再用适量JC-10 染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4. 对于贴壁细胞

【注意】：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的方法进行检测。

1） 对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可用PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

2） 加入1mL JC-10 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期间，按照每1mL JC-10 染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-10 染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

4） 37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-10 染色缓冲液（1×）洗涤2 次。

5） 加入2mL 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

6） 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5. 对于纯化的线粒体

1） 将配制好的JC-10 染色工作液再用JC-10染色缓冲液（1×）稀释5 倍。

2） 0.9mL 5倍稀释的JC-10 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100μg 纯化的线粒体。

3） 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（time scan），激发波长为490nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为490nm 时，可在475～520nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6 中的波长设置进行荧光检测。

4） 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6. 荧光观测和结果分析

检测 JC-10 单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为525nm；检测JC-10聚合物时，可以把激发光设置为540nm，发射光设置为595nm。

【注1】：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-10聚合物时可使用常来检测TRITC用的标准带通滤波器。检测JC-10单体可使用常来检测FITC或GFP的标准带通滤波器。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现绿橙色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

【注2】：由于红色的JC-10信号淬灭比绿色快，所以用标准带通滤波器检测时先检测红色荧光。

相关产品

— — Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/JP金畔所有】

规格信息

JC-10 for Mitochondrial Membrane Potential 线粒体膜电位荧光探针

货号： JP3206-25MG 品牌： Jinpan 标签： 细胞生物学研究

描述

JC-10（JC-1优越替代物）线粒体膜电位荧光探针

温馨提示：见我司整理线粒体荧光探针产品专题。

产品标签

JC-10；JC-1；Rhodamine 123 罗丹明123； CCCP；Mitochondrial Membrane Potential 线粒体膜电位探针；CAS：47729-63-5

订购信息：现货供应。欢迎来电咨询，电话：021-50837765 ，18121428569；QQ：3308240863， 2971634497。

产品描述

JC-10是一种新型的用来监测线粒体膜电位变化的荧光探针，是JC-1的优越替代物。与JC-1相比，具有以下几个重要优势：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明显降低；2）使用更方便——简化步骤将手动操作时间最小化；3）荧光信号更高——改良的信号与背景荧光的信噪比；4）结果更稳定——优化探针以保证更连续性和稳定性结果。

JC-10是一种替换JC-1，用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。JC-10以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。正常线粒体内，JC-10聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-10只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不仅可用于定性检测，因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测，因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时，只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

JC-10可用来检测大量细胞类型如神经元和心肌细胞的线粒体膜电位，也可用来研究重要的细胞生理活动，比如ATP合成，活性氧（ROS）和凋亡发生等。

本品以粉末形式提供，只需溶于DJPO配制成2mg/ml的储存液，然后用合适的缓冲液稀释到工作浓度即可使用。

产品特性

1）同义名：Enhanced JC-1;

2）分子量：~600 g/mol

3） 纯度：＞95%（HPLC）

4） 溶解性：DJPO（2mg/ml）

保存与运输方法

保存：-20℃避光保存，至少1年有效。

运输：室温运输。

注意事项

1. JC-10是光敏感性的，所有染色步骤的操作过程中避免强光接触。
2. JC-10染色完成后，立即进行后续的结果分析非常必要；
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 染色工作液制备

JC-10储存液制备：取本品溶于无水DJPO配制成2mg/ml储存液（比如5mg JC-10加入2.5ml DJPO），混匀后，按照单次用量分装，避光冻存，避免反复冻融。

JC-10（1×）工作液制备：取一管JC-10储存液置于室温，使其充分融化，之后用HHBS（1×Hanks with 20 mM Hepes buffer, pH 7.0）或其他缓冲液（pH 7-8，含0.02% Pluronic®F-127）配制成10-30μM的1×工作液，漩涡混匀待用。

【注意】：对于某些细胞系pH8的工作液可能防止JC-10泄露。

2. JC-10染色步骤（荧光酶标仪）

1）用待测药物处理细胞一段时间（比如，Jurkat细胞用喜树碱camptothecin）处理4-6h）以诱导凋亡。对于空白孔（不含细胞的培养基）加入相应体积的药物缓冲液。

2）按照100μl/孔/96孔板或25μl/孔/384孔板的量加入JC-10工作液到培养孔内。

3）将整个培养板置于37℃，5% CO2孵育15-60min。【注意】：合适的孵育时间取决于细胞类型和细胞浓度。每次试验建议优化孵育时间。

4）用荧光酶标仪监测Ex/Em = 500/525 nm（FITC通道）和540/595 nm（TRITC通道）的荧光变化，计算两者荧光信号比值，以判断细胞健康程度。

【可选】：吸掉JC-10染色工作液，按照100μl/孔/96孔板或25μl/孔/384孔板的量加入HHBS缓冲液或其他生理缓冲液，然后再进行荧光信号分析。

3. JC-10染色步骤（荧光显微镜或流式细胞仪）

1）用待测药物处理细胞一段时间（比如，Jurkat细胞用喜树碱camptothecin）处理4-6h）以诱导凋亡。对于空白孔（不含细胞的培养基）加入相应体积的药物缓冲液。

2）离心去上清，调整细胞密度为1-5×105细胞/管。

3）用500µl JC-10染色工作液重悬细胞。

4）室温孵育或37℃，5%CO2孵育10-30 min，避光。【注意】：合适的孵育时间取决于细胞类型和细胞浓度。每次试验建议优化孵育时间。

5）用荧光显微镜分别观察Ex/Em = 490/525 nm（FITC通道）和540/595 nm（TRITC通道）的荧光变化；或者用流式细胞仪（FL1和FL2通道进行检测）。

【可选】：离心后吸掉JC-10染色工作液，加入500µl HHBS缓冲液或其他合适缓冲液重悬细胞使其密度为1-5×105细胞/管，然后再进行荧光分析。

应用示例（荧光显微镜观察）：

文献来源：Yokokura S et al. Calmodulin antagonists induce cell cycle arrest and apoptosis in vitro and inhibit tumor growth in vivo in human multiple myeloma. BMC Cancer. 2014 Nov 26;14:882.

实验方法（线粒体膜电位去极化检测）：A total of 1 × 106cells were loaded with 10 μg/ml of JC-10 at 37°C for 30 min. Next, the cells were treated with 60 μM of CaM antagonists at 37°C for 1 h and the visualized using a fluorescence microscope (Olympus BX-51/DP-72; Olympus, Tokyo, Japan) fitted with a WIB filter (excitation, 460–490 nm; dichroic mirror, 505 nm; emission barrier filter, 510 nm).

实验结果（线粒体膜电位去极化检测）：

Fig 1. Effects of CaM antagonists on intracellular Ca2+levels and mitochondrial membrane potential. Cells were pretreated with JC-10 dye for 30 min, and subsequently incubated with CaM antagonists (60 μM) for 1 h. The cells were then visualized under a fluorescence microscope to visualize the yellow fluorescent aggregation that indicates high mitochondrial membrane potential which is distinct from the green fluorescent monomer observed at a low mitochondrial membrane potential.

相关产品：进口品质，现货供应。欢迎来电咨询，电话：021-50837765 ，18121428569；QQ：3308240863， 2971634497。

规格信息