如何选择染料

为了使用荧光标记物获得最佳结果，必须考虑几个因素。

首先，这是激发光源：为了减少样品自发荧光可能产生的干扰，激发波长优选在550 nm甚至600 nm以上。除了减少背景之外，红色光谱范围在处理活细胞时也具有优势，因为可以减少损伤。

其次，荧光标记应在激发波长下具有强吸收以及高荧光量子产率。消光系数和荧光量子产率的乘积通常称为染料的“亮度”。

染料的荧光效率在光谱的蓝色和绿色区域最高。在某些情况下，量子产率几乎达到100%的理论极限。对于更长的波长，发射的量子产率急剧下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功开发出即使在 650 nm 下也具有高量子产率的荧光标记。例如，ATTO 647N在水溶液中发出的荧光强度是旧花青染料 Cy5 ™的两倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相对荧光强度。PBS 水溶液1 cm 池中相应吸收最大值处的吸光度为 0.04。22 °C 时两个吸收光谱（相同吸收）交叉处的荧光激发。

 
最后，标记物的发射光谱应与所用滤光片组的传输相匹配。反过来，必须选择滤光片组，使其阻挡样品散射的激发光并允许荧光尽可能有效地通过。

当使用波长为 635 nm 的二极管激光器作为激发源以及在 650 nm 至 750 nm 之间具有高透射率的滤光片组时，例如ATTO 647N将是一个非常好的选择。从ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm处具有高消光系数，接近吸收曲线最大值的波长，以及优异的荧光量子产率（η fl = 65%）。

下表概述了一些常用的激励源和推荐的ATTO标签。
 

荧光标记物的特性
然而，应该注意的是，除了已经讨论的光学考虑因素之外，选择标记时其他因素也很重要，例如染料的 pH 依赖性光学和化学特性、其溶解度、光和化学特性稳定性、发色团的大小或连接体的长度等，其涉及或满足各自应用的要求。这些特性与染料作为荧光标记物的适用性非常相关。

最重要的是，染料在照射过程中保持完整。许多常见的标记，例如荧光素衍生物 FITC，具有非常低的光稳定性。因此，当长时间观察过程时，使用高强度激光激发时成像的灵敏度和质量会受到限制。这对于显微镜和其他基于共焦原理的技术（例如单细胞的检测）来说是一个严重的缺点。与一些常用的旧染料相比，新型ATTO标签的设计即使在长时间暴露后也显着更加稳定。

ATTO 655与传统 Cy5的光稳定性比较TM在水里。使用 250 W 卤钨灯照射，聚焦到 1 cm 池中。消光与照射持续时间。

许多常见的荧光标记物即使在没有照射的情况下（即在黑暗中）也会分解，特别是当暴露于实验室大气中的低浓度臭氧时。在相同的臭氧暴露条件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的稳定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM长 100 倍。这在微阵列应用中非常重要，因为染料分子位于表面，因此直接暴露在大气中。

紧凑而强大的激光二极管现在覆盖了光谱的整个可见光和近红外部分。它们已作为非常有效的激发源进入许多应用/设备，并越来越多地取代传统光源。

如果没有最大吸收与现有激发源的波长完*对应的标记，则应选择波长稍长的染料。吸收会稍微降低，但激发波长和荧光光谱之间的较大差异（与激发波长无关）具有在检测过程中更好地分离散射激发光的优点。

什么是染料聚集Farbstoff-Aggregation？

通过吸收光，染料分子进入电子激发态。吸收的能量仅存储很短的时间，并在激发态寿命结束后再次发射，例如作为荧光。

在染料溶液中，被激发的染料分子（被视为点偶极子或振荡器）如果它们之间的距离足够大，则不会相互影响。因此，整体中存在的发色团的吸收和荧光不会改变。

发色团之间的平均距离约为 5 – 10 nm，影响仅通过振荡器的“辐射场”发生，即没有直接接触。例如，通过福斯特共振能量转移（FRET）模型描述了两种染料分子之间的这种类型的相互作用。

如果发色团之间的距离变得更小，例如在非常浓缩的溶液中，则由于各个振荡器的静电力，可能会产生强烈的相互影响。由于单个染料分子的分子间相互作用，这种染料溶液的吸收和荧光行为都会发生显着变化。

罗丹明 6G 水溶液
在罗丹明6G浓水溶液的紫外/可见光谱中，在主吸收带的短波边缘可以观察到肩峰的出现。如果通过稀释溶液来改变浓度（c），并以同样的方式增加比色皿的层厚度（d），那么根据朗伯-比尔定律，人们总是可以预期相同的消光，则以下过程是观察到：等吸光点的出现。

– 所有相关物质的浓度变化是线性的，dE/dc = 0 – 表明两种（或更多）物质以一种确定的方式相互转化或彼此处于平衡状态。所以这是一个动态平衡。



解离或二聚常数可以通过实验确定：在稀释系列中，溶液的稀释始终通过层厚度的变化进行补偿，可以计算“有效消光系数”。初始浓度由未发生二聚化的高度稀释溶液的紫外光谱确定。由于各个吸收在朗伯-比尔定律中表现相加，因此可以使用反应方程或质量作用定律来制定有效消光或有效消光系数。

疏水相互作用
有机染料的聚集尤其发生在水或具有高离子强度的溶剂中。主要原因是分子间范德华力：通过所谓的“疏水相互作用”，亲脂性分子试图“避开”亲水性水分子，即为水化壳提供尽可能小的表面积。这种现象还导致玻璃表面上的染料吸附或与基质分子的非特异性结合。

形成二聚体或更高聚集体的倾向取决于
 

由于这是动态平衡（如上所述），因此可以通过稀释溶液将二聚体转化回单体。当测量的吸收光谱不再随着进一步稀释和层厚度的相应增加而变化时，达到“单体光谱”。对于大多数疏水性ATTO染料，这种情况发生在消光度约为 0.04 时（层厚 1 cm；c = 10 -7 – 10 -6 mol/l）。

蛋白质缀合物中的分子内相互作用/DOL 测定
当染料-NHS 酯与蛋白质的氨基反应时，可以形成染料缀合物，其中共价结合的染料分子非常接近并且可以彼此相互作用。这以同样的方式通过吸收光谱的强烈变化来表达，正如在 ATTO 565-steptavidin 缀合物的示例中可以清楚地看到的：在缀合物光谱中观察到额外的短波吸收带，

类似于浓度足够高的染料水溶液的“二聚体带”。由于在这种情况下共价结合的染料分子之间存在分子内相互作用，因此当缀合物溶液稀释时吸收光谱不会改变！
对于这种情况，染料-蛋白质比率（标记度，DOL）的确定在我们的“蛋白质标记“工作说明中进行了描述。


两种形式的聚集体之间存在基本区别：

H-聚集体（H = 低色），短波长。
当两个或多个染料分子以一种其跃迁偶极矩（通常在 S 0 – S 1过渡中彼此平行（沿着发色团系统的纵轴运行）。观察到向低色位移的吸收带 – 与单体吸收相反。

由于空间接近，电子结构相互影响，可以说，两个分子必须一起观察。能级被分裂，并且量子力学现在允许的吸收跃迁能量更高，因此波长更短。从这种较高的激发态，发生快速内部转换（IC），从而使荧光猝灭。

J-聚集体（根据 EE Jelley 的说法），长波
这种类型的聚集会导致吸收带的长波偏移，这与能带半宽度的显着减小有关。

J-聚集体通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或类似的发色团。Jelley 和 Scheibe 使用假异花青染料独立观察到了这一现象。对于由单个染料组装形成的“超分子聚合物”的模型描述，已经提出了各种类型。对分子关系简单的描述是这样的想法：各个分子一个接一个地排列，使得跃迁偶极矩也位于一条线上。分子的共同考虑导致能级的分裂：量子力学允许的跃迁现在能量较低，

溶剂成分、盐或其他物质的添加以及浓度会极大地影响聚集。在理想条件下，可以在紫外/可见光谱中找到所描述的极窄吸收带。此外，与 H 聚集体相比，这里当然可以观察到荧光，特别是在较低温度下：发射带的最大值也很窄，仅比吸收最大值长几纳米。
根据实验条件，文献还描述了吸收带的“加宽”，这可以通过包含 J 聚集体的禁电子跃迁来解释。

ATTO 488 标记的磷脂
溶液纯氯仿中的ATTO 488标记磷脂最初因其意想不到的颜色而令人惊讶：暗淡的溶液呈现粉红色至洋红色，而不是带有亮绿色荧光的浅黄色。长波位移吸收可以通过 J 聚集体的存在来解释。当所讨论的溶液用甲醇稀释时，颜色变为通常的黄色，并且可以看到强烈的荧光。通过改变溶剂成分，聚集体被推回。
下图显示了ATTO 488标记的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE) 在纯氯仿和氯仿/甲醇（8:2，v/v）溶剂混合物中的溶液：

荧光染料标记法的应用

荧光染料标记是生物学、生物化学和药理学等各个领域广泛使用的技术。它是可视化和量化生物分子和结构的强大工具。荧光染料标记用于标记核酸、蛋白质或其他生物分子。荧光染料通常是小的有机分子，它们吸收某一波长的光并发射更长波长的光。这一特性使得荧光染料能够以多种方式用于检测、定量和可视化分子。

历史
荧光染料标记自 20 世纪 50 年代以来一直被使用。最初，它被用作标记蛋白质的方法，以研究细胞中蛋白质的结构和功能。从那时起，它就被用来研究各种生物分子和过程。 20 世纪 70 年代，荧光染料标记被用于研究 DNA，使研究人员能够可视化和量化细胞中的遗传物质。 20世纪80年代，荧光染料标记被用来研究细胞中蛋白质的结构和功能。 20世纪90年代，荧光染料标记被用于研究多种生物过程，如细胞周期调控、信号转导和基因表达。

应用
荧光染料标记可用于多种领域来研究生物分子和过程。它用于研究蛋白质、DNA 和其他生物分子的结构和功能。它还用于临床诊断，以检测和量化致病因子，例如细菌和病毒。此外，荧光染料标记用于药物发现中，以识别和量化药物靶点。（您可能想了解更多有关荧光染料应用的信息）

蛋白质标记
荧光染料标记用于研究蛋白质的结构和功能。研究人员使用荧光染料来标记蛋白质，以便可视化和量化它们。这可以直接或间接完成。直接标记涉及将荧光染料直接附着到感兴趣的蛋白质上。间接标记涉及将荧光染料附着到与目标蛋白质结合的特定抗体或其他分子上。这使得研究人员能够专门标记感兴趣的蛋白质。荧光染料标记可用于研究蛋白质的结构和功能，以及研究蛋白质-蛋白质相互作用。 （您可能还需要荧光染料清单）

DNA 标记
荧光染料标记也用于研究 DNA 的结构和功能。研究人员使用荧光染料来标记 DNA，以便对其进行可视化和量化。这可以直接或间接完成。直接标记涉及将荧光染料直接附着到感兴趣的 DNA 上。间接标记涉及将荧光染料附着到特定抗体或其他与目标 DNA 结合的分子上。这使得研究人员能够专门标记感兴趣的 DNA。荧光染料标记可用于研究 DNA 的结构和功能，以及研究 DNA-蛋白质相互作用。

细胞成像
荧光染料标记也用于研究中以可视化和量化细胞。这可以直接或间接完成。直接标记涉及将荧光染料直接附着到感兴趣的细胞上。间接标记涉及将荧光染料附着到与感兴趣的细胞结合的特定抗体或其他分子上。这使得研究人员能够专门标记感兴趣的细胞。荧光染料标记可用于研究细胞的结构和功能，以及研究细胞与细胞的相互作用。

临床诊断
荧光染料标记也用于临床诊断，以检测和量化致病因子，例如细菌和病毒。这可以直接或间接完成。直接标记涉及将荧光染料直接附着到感兴趣的致病因子上。间接标记涉及将荧光染料附着到与感兴趣的致病因子结合的特定抗体或其他分子上。这使得研究人员能够专门标记感兴趣的致病因子。荧光染料标记可用于检测和量化致病因子，以及研究它们的结构和功能。

药物发现
荧光染料标记也用于药物发现，以识别和量化药物靶点。这可以直接或间接完成。直接标记涉及将荧光染料直接附着到感兴趣的药物靶标上。间接标记涉及将荧光染料附着到与感兴趣的药物靶标结合的特定抗体或其他分子上。这使得研究人员能够专门标记感兴趣的药物靶点。荧光染料标记可用于识别和量化药物靶标，以及研究其结构和功能。

结论
荧光染料标记技术在生物学、生物化学和药理学等多个领域得到广泛应用。它是可视化和量化生物分子和结构的强大工具。荧光染料标记用于标记核酸、蛋白质或其他生物分子。它用于研究蛋白质、DNA 和其他生物分子的结构和功能。它还用于临床诊断，以检测和量化致病因子，例如细菌和病毒。此外，荧光染料标记在药物发现中用于识别和量化药物靶标。