ELISA的基本设计介绍
ELISA的基本设计如下:
抗体结构介绍
抗体，也称为免疫球蛋白 (Ig)，于 1890 年被描述，是一种大型 Y 形糖蛋白，免疫系统使用它来识别和中和外来抗原，例如细菌或病毒。抗体几乎能够结合任何非自身表面，具有精细的特异性和高亲和力。这些属性使抗体不仅是免疫的关键，而且是生物医学研究、诊断和治疗的工具。
抗体由两条重链和两条轻链组成。根据多肽序列的微小差异，轻链分为 kappa (κ) 或 lambda (λ) 链。重链定义了抗体的类别或同种型。每条组分链包含一个 NH2 末端可变结构域和一个或多个 COOH 末端恒定结构域。每个可变域或恒定域由大约 110-130 个氨基酸组成。两条轻链仅包含一个恒定结构域，而重链则包含三个或四个恒定结构域，这定义了同种型。具有三个恒定结构域的重链往往包括第一恒定结构域和第二恒定结构域之间的间隔铰链区。典型的轻链的质量约为 25 kDa，三恒定结构域重链及其铰链的质量约为 55 kDa。
抗体被分为由各个类型的重链恒定结构域定义的同种型，每种同种型由单独的恒定结构域基因编码。同种型之间重链恒定结构域的差异包括链间二硫键的数量和位置、连接的寡糖部分的数量、恒定结构域的数量和铰链区的长度。在哺乳动物中，抗体分为五种同种型：IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。在人类和小鼠中，基于二硫键数量以及铰链区长度和柔性的微小差异，免疫球蛋白 IgG 进一步分为亚类（例如小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c 和 IgG3）。各种抗体同种型的生物学特征、结构、靶点特异性和分布各不相同。
体内发现的最主要的同种型是 IgG。它在所有免疫球蛋白同种型中具有最长的血清半衰期。根据重链恒定区的结构、抗原性和功能差异，IgG进一步细分为四个亚类。 IgG 亚类表现出不同的功能活性。例如，IgG1 和 IgG3 抗体通常是响应蛋白质抗原而诱导的，而 IgG2 和 IgG4 则与多糖抗原相关。
循环 IgD 在血清中的含量非常低，并且血清半衰期很短。 IgD 的功能尚不清楚。
IgE 的血清水平低，并且在所有抗体同种型中半衰期最短。 IgE 与超敏反应和过敏反应以及对寄生虫感染的反应有关。
IgA 血清水平往往高于 IgM，但远低于 IgG。 IgA 通常以单体形式存在于血清中，但它可以形成二聚体，其中第三个恒定区通过二硫键与多肽链（即 J 链）结合。 IgA 还含有分泌成分。分泌组分通过二硫键连接至二聚体的第二恒定结构域。 IgA 通过直接中和或防止与粘膜表面结合，对于抵御毒素、病毒和细菌至关重要。
免疫反应期间产生的第一种抗体是 IgM。成熟和抗原刺激后，IgM 单位通过第四恒定区中的二硫键相互连接，形成五聚体 IgM。五聚体 IgM 还包含 J 链，它通过二硫键与两个单体结合。一般来说，单体 IgM 分子由于其不成熟而具有低亲和力，然而，五聚体 IgM 可以通过五聚体抗体和抗原之间的多聚体相互作用实现高亲和力，特别是当抗原含有多个重复表位时。
所有抗体均含有 2 个 F(ab) 区和 1 个 Fc 区。 F(ab) 区对应于抗体分子的两个相同的臂，其包含与重链的可变域和第一恒定域配对的完整轻链。 Fc区对应于重链的恒定结构域，不包括第一恒定结构域。这三个区域通常称为片段，可以通过蛋白水解酶消化来分离。用木瓜蛋白酶消化将抗体切割成三个片段，即两个 F(ab) 片段和一个 Fc 片段，而胃蛋白酶不会分离两个 F(ab) 片段，从而产生一个 Fc 片段和一个 F(ab')2 片段由通过二硫键连接的两个 F(ab) 片段组成。F(ab) 和 F(ab')2 片段即使在消化后仍保留结合抗原的能力，这使其成为某些免疫化学技术和实验应用的理想选择。
Phospho-Tau Thr217 (p-tau217) 多克隆抗体简介
描述：磷酸化 Tau Thr217 (p-tau217) 多克隆抗体 (PAB)。该抗体 (TBS10021) 与小鼠单克隆抗体 ( TBS10022 )配对用于 ELISA，如图 1 所示。该抗体可用于人、大鼠和小鼠脑组织中的蛋白质印迹（图 2）或 IHC。
特异性：该抗体与磷酸 tau Thr217 发生特异性反应。
物种反应性：与：人类、小鼠和大鼠发生反应。
寄主动物：兔子。
同种型： IgG。
免疫原：合成的磷酸-tau thr217 肽
形式：纯化的液体。
纯化： DEAE色谱法。
浓度： 1.0毫克/毫升。
亲和常数：未确定。
缓冲液： 15% 甘油、10 mM PBS、0.05% NaN3、pH 7.2
应用：该抗体 (TBS10021) 与小鼠单克隆抗体 ( TBS10022 ) 配对，用于 ELISA、CLIA 和侧流层析。该抗体可用于人、大鼠和小鼠脑组织的蛋白质印迹或 IHC。
储存： -20℃保存2年。
如何选择正确的二抗？
确保匹配良好–宿主物种是产生第二抗体的动物，应始终与第一抗体的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中产生的一抗，您将需要在不同于兔子的物种（如山羊、驴或小鼠）中产生的抗兔二抗（图1）。
完整抗体还是片段？
多克隆一抗包含几种同种型免疫球蛋白g的混合物。因此，为了最大限度地检测目标，最好使用能识别所有同种型的二抗。多克隆抗体通常以全抗体形式（重链+轻链）饲养在兔、山羊、绵羊和驴中，因此第二宿主物种必须用来自不同物种的IgG池进行免疫，从而使纯化的第二抗体能够识别所有形式。例如，如果初级多克隆抗体是山羊IgG，您将需要抗山羊IgG（H+L）。然而，全抗体可能导致高背景和较低的特异性，因为所有免疫球蛋白共享轻链，这增加了交叉反应性（图2）。
根据您的应用选择共轭物
亲和纯化抗体与交叉吸附抗体
总之，二级抗体的选择取决于手头的应用和目标丰度所需的灵敏度和纯化水平以及非特异性结合的风险。
磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔单克隆抗体产品信息
反应性HMR Hm Mk Pg
灵敏度内源性
分子量（kDa）65
来源/同种型兔免疫球蛋白G
产品使用信息
应用稀释
蛋白质印迹法1：1000
Simple Western™1:10 – 1:50
免疫沉淀1:50
免疫荧光（免疫细胞化学）1:800 – 1:3200
流式细胞仪（固定/透化）1:800 – 1:3200
贮存 含有 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 叠氮化na。储存于 –20°C。不要等分抗体。
蛋白质印迹实验方案 对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育过夜，并轻轻摇动。 注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
A. 溶液和试剂 从样品制备到检测，您的蛋白质印迹所需的试剂现在都在一个方便的套件中：#12957蛋白质印迹应用解决方案套件 注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：( #9808 ) 要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中，混合。
10X Tris 缓冲盐水 (TBS)：( #12498 ) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。
1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 ( #7722 ) 或红色上样包 ( #7723 ) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH 2 O稀释至 1X。
10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：( #4050 ) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。
10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：( #12539 ) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中，混合。
10X Tris 缓冲盐水与 Tween ® 20 (TBST)：( #9997 ) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。
脱脂奶粉：（#9999）。
封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 毫升，将 7.5 克脱脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。
洗涤缓冲液：( #9997 ) 1X TBST。
牛血清白蛋白 (BSA)：( #9998 )。
一抗稀释缓冲液：1X TBST，含 5% BSA；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。
生物素化蛋白梯检测包：( #7727 )。
蓝色预染蛋白质标记物，宽范围 (11-250 kDa)：( #59329 )。
印迹膜和纸：( #12369 ) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。
与 HRP 缀合的二抗：抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 )。
检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。
B. 蛋白质印迹 样品制备的通用方案。
通过添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞所需的时间。
从文化中吸取介质；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。
添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl，10 cm 直径板每孔 500 µl）裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管中。保持在冰上。
超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
将 20 µl 样品加热至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。
微量离心 5 分钟。
将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。
注：建议加载预染色分子量标记（#59329，10 µl/泳道）以验证
电转移和生物素化蛋白质梯（#7727，10 µl/泳道）以确定分子量。
电转移至硝酸纤维素膜 ( #12369 )。
C. 膜封闭和抗体孵育
注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。
I. 膜封闭
（可选）转膜后，用 25 ml TBS 室温清洗硝酸纤维素膜 5 分钟。
将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。
用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
二.一抗孵育
将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。
用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
将膜与抗兔 IgG、HRP 连接抗体 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 连接抗体 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育，以检测 10 ml 溶液中的生物素化蛋白质标记物室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。
用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 继续检测（D 部分）。
D. 蛋白质检测
使用指南：
在 TBST 中洗涤膜结合的 HRP（抗体偶联物） 3 次，每次 5 分钟。
通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 ( #6883 )。搅拌均匀。
将基质与膜一起孵育 1 分钟，除去多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露于 X 射线胶片。
* 避免反复接触皮肤。