AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试!

AAV核酸滴度定量检测知多少

随着基因治疗技术日趋完善和临床经验不断积累,监管机构对基因治疗产品的质量控制也愈发严谨慎微。准确的滴度检测是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分,也是开展临床研究的前提条件,AAV基因治疗临床试验检测方法汇总如下表。

检测项目

检测方法

一般理化指标

外观

直接检测法

pH

电位滴定法

渗透压

渗透压测定法

纯度

蛋白含量

SDS-PAGE/银染

病毒颗粒聚集体

动态光散射

空壳率

透射电镜

OD260/OD280

分光光度计法

宿主DNA残留

qPCR

质粒DNA残留

qPCR

HKE293/BSA

ELISA

核酸酶

ELISA

性能

核酸滴度

qPCR

转染效率/感染滴度

TCID50

基因表达

ELISA

体外活性

安全性

内毒素

凝胶限度试验法

无菌

培养法

复制型AAV

培养法

其中核酸滴度检测是以AAV衣壳中所含基因组作为定量依据,测定的是含有目标基因组的AAV浓度。AAV中包含的基因组是其表达蛋白或RNA的前提,是AAV药物发挥药效的核心和基础。目前AAV核酸滴度检测方法有点杂交法、分光光度计法和qPCR法,qPCR作为第二代PCR方法,是各大研究机构和药企最广泛采用的定量方法。然而qPCR技术存在较大局限性,如检测结果只是相对标准曲线的“相对”定量,且反应容易受qPCR体系中酶或蛋白等成分的干扰,定量结果不够精准等。

ddPCR方法 vs qPCR方法

  • 数字PCR(ddPCR)被称为第三代PCR技术,与qPCR技术相比具有以下显著优势:
  • ddPCR无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量;
  • ddPCR有更高的准确度,定量CV值通常小于10%;
  • dPCR抗干扰能力更优,有实验显示,ddPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术[1]

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qPCR方法与数字PCR方法优劣势比较

另一组测试数据也显示[2],优化后的qPCR方法中位CV分别为5.35%和4.37%,较大值分别为33.2%和8.7%,而数字PCR用三个独立引物探针组的中位CV值为2%或更低,且分布更密集,可见数字PCR方法定量更加准确,重复性更高。

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从监管趋势来看,美国药典在细胞和基因治疗标准品章节中明确写道,AAV标准品定量将会使用数字PCR进行定量,可见数字PCR方法在细胞和基因治疗领域中绝对定量的突出优势。

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达普生物AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒邀请广大客户进行内部测试

综上所述,在以AAV为递送载体的基因治疗产品的定量检测中,ddPCR技术已受到越来越多业内人士的青睐,为了满足广大客户的需求,达普生物即将推出其自主研发的AAV基因组ddPCR精准定量试剂盒。上海金畔生物科技有限公司作为达普生物中国一级代理商,现携手达普生物开展“AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试活动”。

报名方法:即日起至2022年6月15日,关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号”(微信号:www.jinpanbio.cn),发送关键词“AAV定量”,填写表单,即可获得免费检测机会。每个客户限测5个样本,名额有限,先到先得!

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上海金畔生物科技有限公司作为专业服务中国生命科学领域16年的供应商,以专业和优质的服务赢得了众多客户的支持和信赖!目前已成为多家世界知名跨国企业中国区研发和生产基地、制药企业与诊断企业以及各大高校与科研院所官方采购平台的指定供应商。其中上海金畔生物科技有限公司一级代理商的达普生物科技有限公司,拥有多个自主研发的仪器平台、全球领先的生物芯片工厂和试剂体系。可广泛应用于病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选和癌症早期筛查等多个领域。

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达普生物科技有限公司由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心,拥有微流控芯片、仪器及试剂 GMP 厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域,致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产的两大技术平台:数字 PCR 系统和单细胞组学系统。产品适合应用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。

参考文献:

  1. Dobnik, David, et al.2019:1570.,Dobnik, David, et al. “Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.” Frontiers in microbiology (2019): 1570.
  2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

常用的病毒基因传递载体包括逆转录病毒(RV)、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)和单纯疱疹病毒(HSV)。其中,AAV属于细小病毒科,是其中最小的单链和无囊膜DNA病毒,目前已发现的血清型有11种。在所有不同血清型的AAV中,重组AAV-2是最常用的一种,它可以通过辅助病毒或Cell Biolabs提供的AAV Helper-Free System来体外生产出高滴度的重组病毒。AAV-2可以感染分裂细胞和非分裂细胞,并能在人类宿主细胞中维持,具有一定的基因稳转潜力。由于AAV-2是一种天然缺陷型病毒,需要在反式结构中提供若干因子才能进行生产性感染,因此被公认为最安全的病毒载体。近年来,利用DNA重组技术开发了一种新型的载体AAV-DJ,是从8种不同血清型AAV重组而来的一个混合衣壳,使其能在各种不同细胞和组织中都具有显著较高体外感染效率的载体。重组的AAV-2和AAV-DJ病毒都可通过CsCl梯度超离法、碘二醇密度梯度超离法或Cell Biolabs的AAV纯化试剂盒来纯化。

利用病毒载体来转导基因必须要准确地测量病毒滴度。传统检测AAV滴度是通过DNA斑点杂交或类似方法来定量AAV基因组拷贝数(GC)。然而这些方法耗时耗力,且稳定性不佳。对于已经高度纯化的病毒样品,也通常用其在260nm的吸光度来估算病毒粒子总数,但这种方法不适用于未纯化的病毒上清,因为其中的杂质成分会影响260nm的光吸收度。

上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs提供了一种快速全面的用于检测纯化后的AAV滴度的试剂盒QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit。该试剂盒包含一个96孔板和足够检测96个样本的试剂,包括已灭活的AAV标准品,通过标准曲线能够计算出样品中纯化后的AAV滴度。该试剂盒检测灵敏度为6.25×108 GC/mL,能够检测AAV-1,AAV-2,AAV-3,AAV-5,AAV-6,AAV-8,AAV-9,AAV-10,AAV-DJ和AAV-DJ/8多种血清型的AAV滴度,并且适用于所有表达系统生产的AAV。

检测原理

AAV衣壳是由VP1、VP2和VP3三种蛋白质混合构成,平均每一个病毒粒子中包含60个VP分子,其比例为5 VP1 : 5 VP2 : 50 VP3。试剂盒中提供的96孔板已预包被了可以结合三种VP蛋白的捕获抗体,当AAV样品或标准品加入到96孔板中,其AAV衣壳蛋白就会与捕获抗体结合。经过孵育和洗板等步骤后,再分别加入AAV VP衣壳抗体和HRP标记的二抗,而未结合的抗体将被洗脱下来。经底物显色后,测定450nm处的吸光度,最后通过AAV标准曲线计算未知样品中AAV衣壳蛋白浓度,进而计算出样本中AAV滴度。

下图展示了AAV滴度检测试剂盒的标准曲线结果。

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

产品特点

  • 通过检测纯化后的重组AAV衣壳蛋白来确定AAV滴度;
  • AAV定量结果由标准酶标仪读取;
  • 试剂盒中提供灭活的AAV标准品;
  • 适用于多种血清型AAV滴度测定,包括AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-5, AAV-6, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-DJ and AAV-DJ/8

产品信息

货号

品名

规格

VPK-5146

QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit

96 assays

VPK-5146-5

QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit

5 x 96 assays

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

Cell Biolabs公司坐落于美国加利福尼亚州圣地亚哥市,一直致力于开发生命科学研究领域的技术和工具,并将所开发的创新性技术成果商业化。Cell Biolabs孜孜不倦的完善产品,以期使细胞功能和疾病机制研究达到新高度。Cell Biolabs公司的产品独具特色并且处于行业前沿水平,全球众多大学、政府研究机构、生物、制药企业的科研实验室均在使用。上海金畔生物科技有限公司是Cell Biolabs中国一级代理,为用户提供完善的技术支持与售后服务。如您对上述产品感兴趣,欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

引用文献

1. Rabinowitz, J, and Samulski, R. J. (1998) Curr. Opin. Biotechnol., 9, 470-475.

2. Summerford, C., and Samulski, R. J. (1999) Nat. Med., 5, 587-588.

3. Clark, K., Liu, X., McGrath, J., and Johnson, P. (1999) Hum. Gene Ther., 10, 1031-1039.

4. Sonntag, F., Schmidt, K., and Kleinschmidt, J.A. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A., 107, 10220-5.

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

腺相关病毒AAV具有表达滴度高、宿主免疫反应轻微、感染谱广、安全性高等优势,成为近年来在基因治疗领域应用广泛的病毒载体之一。上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs (AAV Helper Free Expression System)的AAV三质粒表达系统也是目前常用的一类AAV载体系统。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

如下图所示,该套AAV系统包含表达载体(Expression vector)、包装质粒(Rep-Cap plasmid)和辅助质粒(pHelper plasmid)。其中表达载体是AAV病毒的核心,包含了ITR序列、CMV启动子、多克隆位点等,用于携带外源基因;包装质粒负责表达AAV病毒的结构蛋白,决定AAV的血清型和组织嗜性。由于野生型AAV是复制缺陷型的,必须依赖辅助病毒(如腺病毒)才可以感染靶细胞。AAV Helper Free Expression System利用在不同质粒上提供这些必要的辅助基因来确保重组AAV病毒具有感染性,消除AAV对辅助病毒的依赖,解决了AAV生产过程中要去除腺病毒污染的难题。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

      Expression vector包含ITR序列,多克隆位点,携带目的基因;

      Rep-Cap plasmid包含Rep和Cap基因,决定了重组AAV的血清型和组织嗜性;

      pHelper plasmid 包含腺病毒的VA、E2A和E4基因,使重组AAV具有感染性。

  1. AAV表达载体

AAV基因组为4.7kb,能够携带的外源基因上限在4kb左右。Cell Biolabs提供了8种AAV的表达载体,兼容常用的各种AAV包装系统,表达载体都携带有2个ITR序列,使AAV基因组能正确形成T-形二级结构,进而保证了病毒的有效复制和包装。载体上有氨苄抗性基因、多克隆位点,还可以根据实验需要选择带标签、无标签、不含启动子或自身互补型(self-complementary)AAV表达载体(产品详情如下表)。

货号

质粒名称

载体容量(kb)

特征

VPK-415

pAAV-IRES-Puro

1.8

Puro标签

VPK-416

pAAV-IRES-Neo

1.6

Neo标签

VPK-417

pAAV-IRES-Hygro

1.4

Hygro标签

VPK-418

pAAV-IRES-GFP

1.7

GFP标签

VPK-419

pAAV-IRES-Bsd

2

BSD标签

VPK-410

pAAV-MCS

3

无标签

VPK-411

pAAV-MCS Promoterless

4

无启动子

VPK-430

pscAAV-MCS

1.5

self-complementary

  1. AAV包装质粒

AAV共有12个血清型,其中AAV1-6是从人类组织中分离获得,并且具有明确的的抗体反应性,是目前常用的经典AAV载体。尽管不同血清型AAV都具有正二十面体结构,但其衣壳蛋白在序列与空间构象上的多样性,使得AAV与不同细胞表面受体亲和力及组织嗜性存在显著差异。在感染嗜性方面,AAV-2的感染谱较广应用较多,AAV-1在骨骼肌中的转导效率较高,AAV-3易于转导巨核细胞,AAV-5和AAV-6感染呼吸道上皮细胞的优势较为显著。因此,根据AAV不同血清型在组织感染性的相对特异性,可以用于在针对不同靶向组织的基因治疗中寻求最佳的AAV载体类型与组合。除了常见的六个血清型AAV之外,Cell Biolabs还提供两种重组型AAV包装质粒即AAV-DJ与AAV-DJ-8,如下图所示,这两种AAV的Rep-Cap基因是由多个野生型AAV的结构基因重组而来,与其他野生型相比,AAV-DJ在体外细胞转导效率更高,AAV-DJ-8则更适用于体内感染实验。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

以常用的AAV-2为参照,下表比较不同血清型AAV对种属、组织细胞的感染率。值得一提的是,AAV-DJ对不同物种的肝细胞、黑色素瘤细胞以及胚胎干细胞的感染能力都有绝对优势,甚至高于常用的AAV-2。

辅助质粒pHelper plasmid是确保重组AAV具有感染性的重要质粒,pHelper载体中包含了腺病毒的E2A、E4基因和VA RNA,由于我们常用的AAV包装细胞系293和293T都含有E1基因,因此该系统中的pHelper质粒上没有再提供E1基因。

AAV包装质粒货号(Rep-Cap&pHelper plasmids)

VPK-401

VPK-402

VPK-403

VPK-404

VPK-405

VPK-406

VPK-400-DJ

VPK-400-DJ-8

细胞系

组织类型

AAV-1

AAV-2

AAV-3

AAV-4

AAV-5

AAV-6

AAV-DJ

AAV-DJ/8

Huh-7

人肝脏

13

100

2.5

0.0

0.1

10

500

0.2

HEK293

人肾脏

25

100

2.5

0.1

0.1

5

500

0.3

HeLa

人子宫

3

100

2.0

0.1

6.7

1

667

0.2

HepG2

人肝脏

3

100

16.7

0.3

1.7

5

1250

0.5

Hep1A

小鼠肝脏

20

100

0.2

1.0

0.1

1

400

0.1

911

人视网膜

17

100

11

0.2

0.1

17

500

0.0

CHO

仓鼠卵巢

100

100

14

1.4

333

50

25000

5.0

COS

非洲绿猴肾脏

33

100

33

3.3

5.0

14

500

0.3

MeWo

人皮肤

10

100

20

0.3

6.7

10

2857

1.0

NIH3T3

小鼠成纤维

10

100

2.9

2.9

0.3

10

500

0.1

A549

人肺脏

14

100

20

ND

0.5

10

1000

0.1

HT1180

人成纤维

20

100

10

0.1

0.3

33

333

0.2

Monocytes

人原代单核细胞

1111

100

ND

ND

125

1429

100

ND

Immature DC

人树突细胞

2500

100

ND

ND

222

2857

200

ND

Mature DC

人树突细胞

2222

100

ND

ND

333

3333

100

ND

ND = Not Determined

上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌除了提供AAV病毒的全套载体系统外,还有腺病毒(Adenovirus),慢病毒(Lentivirus)和逆转录病毒(Retrovirus)载体系统,为广大科研用户提供了高效、便捷的病毒载体产品库,小编之后还会一一为大家介绍这些病毒载体,敬请期待!

上海金畔生物科技有限公司作为Cell Biolabs中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为广大生物科技领域科研与企业客户提供高品质产品与优质服务,如果您对上述产品感兴趣,欢迎随时拨打全国客服热线021-50837765或登录上海金畔生物科技有限公司官方网站www.jinpanbio.cn查询订购!

腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)作为基因治疗的载体存在一些非常突出的优点,比如能感染分裂和非分裂细胞、不具有明显的致病性、整合至宿主特定染色体长期表达目的蛋白等,已成为基因治疗被广泛应用的安全、有效的载体。腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

在腺相关病毒的应用过程中,我们经常需要获得病毒液的病毒含量或者腺相关病毒的滴度数据。传统的方案是使用DNA点杂交或其他类似方法来测量腺相关病毒感染滴度,但是这种传统的方法实验周期较长,操作繁琐。对于已获得了高纯度AAV颗粒的检测,使用OD260nm处光吸收度数值来衡量AAV的病毒颗粒含量不失为一种更便捷的方案,遗憾的是,这种方法不适用于未纯化的病毒颗粒,因为其它的杂质会干扰260nm处的吸收度。另外,采用免疫学的办法,使用与AAV病毒颗粒结合的抗体来检测腺相关病毒含量也有被使用,但是很显然,这种方法将会检测所有AAV病毒,包括不含有基因组DNA的包装颗粒。

Cell Biolabs的QuickTiter™ AAV Quantitation Kit试剂盒(目录号:VPK-145)很好的解决了上述问题,该试剂盒包括试剂A、试剂B、捕获Matrix、洗脱液、溶液C、Dye染料以及AAV DNA标准物。本腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺病毒DNA含量来测定其病毒含量。

该腺相关病毒定量试剂盒的工作步骤是首先降解悬液里的核酸成分,然后使用Matrix胶有效结合腺相关病毒颗粒,从而分离出杂质蛋白及蛋白复合物,洗脱下AAV颗粒后进行变性,随后用染料对核酸进行染色。

由于采用了专利技术的捕获Matrix胶,不但能专一性的结合腺相关病毒颗粒,因此能有效的提高检测效度;而且可以用于未纯化的AAV病毒液,因此可定量已经纯化的AAV病毒以及未纯化的AAV病毒。经过相关步骤后,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照AAV DNA标准曲线得出AAV滴度。该试剂盒检测灵敏,对于已经纯化的AAV DNA,可以在2小时内获得数据,可检测1×109GC/ml的AAV;对于未纯化的DNA,需要使用Kit提供的提纯试剂纯化再测量,大概在3-4小时左右完成,可检出5×1010GC/ml腺相关病毒。该试剂盒能从无辅助病毒的AAV病毒液内完成20次检测。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ AAV Quantitaiton Kit VPK-145 荧光检测,20次分析

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺相关病毒相关产品和服务,产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术,无需超速离心,在大大减少试验时间的同时还保证了AAV的纯度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺相关病毒DNA含量来测定其病毒含量,只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转导试剂能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转导效率,包括传统转染方法转导效率低的非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺相关病毒纯化方案——Cell Biolabs的AAV纯化试剂盒

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)作为基因治疗的载体存在一些非常突出的优点,比如能感染分裂和非分裂细胞、不具有明显的致病性、整合至宿主特定染色体长期表达目的蛋白等,已成为基因治疗被广泛应用的安全、有效的载体。

AAV病毒纯化的传统方法是加热失活法和平衡密度梯度离心法。目前大多数腺相关病毒都来源于AAV-2血清型腺病毒。对于AAV-2而言,由于其表面存在细胞表面受体,能有效结合到某些蛋白上,所以能使用亲和层析法纯化,因此也就避免了CsCl2和辅助包装病毒的污腺相关病毒纯化方案——Cell Biolabs的AAV纯化试剂盒染。这些细胞表面受体包括硫酸乙酰酣素糖蛋白受体、联合辅助受体等,如使用肝素亲和层析方案进行腺相关病毒,但是这种方案需要对纯化前的病毒液进行预处理。因此这些方法在具体的运用时都存在一定的缺陷,如单一的CsCl2超速离心较为耗时,而且纯度上也不是很高,而肝素亲和层析以及进行的预处理,在经济性和时效性方面尚有不足。

Cell BioLabs为您提供了新型高效的腺相关病毒提取纯化方案,ViraBind™ AAV Purification Kits试剂盒(货号:VPK-140)采用特殊的专利Matrix技术,该纯化Matrix胶能特异性吸附腺相关病毒颗粒,大大减少试验时间的同时还保证了腺相关病毒的纯化度。后继采用常规离心的方式(较大10,000g x10min),整个过程只需3个小时,回收率高达60%。

ViraBind™ AAV Purification Kit每次能处理一个150mm培养皿或两个100mm大小培养皿内的病毒感染细胞液,并获得100ul的高纯度腺相关病毒液。每个Kit可完成10次纯化,经SDS验证无杂蛋白条带,具有较高的感染滴度。获得的腺相关病毒感染原代细胞有非常好的效果。

另外针对一些需要腺相关病毒大量提取的用户,Cell Biolabs还提供了AAV的大提试剂盒ViraBind™ AAV Purification Mega Kit(货号:VPK-141/VPK-141-5),在具体的纯化后继步骤中,使用透析柱装置,每次可进行10个150mm培养皿大小的病毒感染细胞的提纯,分2次大提和10次大提两个包装。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
ViraBind™ AAV Purification Kit VPK-140 10次纯化,每次2个10cm板细胞
ViraBind™ AAV Purification Mega Kit VPK-141 2次纯化,每次10个15cm板细胞
VPK-141-5 10次纯化,每次10个15cm板细胞

 美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺病毒相关产品和服务,产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术,无需超速离心,在大大减少试验时间的同时还保证了腺相关病毒的纯化度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺病毒DNA含量来测定其病毒含量,只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转染试能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转染效率,包括传统转染方法转导较低的细胞非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品或者腺病毒、慢病毒以及逆转录病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。