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如何进行ELISA的构建？

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如何进行ELISA的构建？

选择您的关键试剂

固相：应选择专门允许结合检测中的抗原或抗体成分的固相以避免背景噪音。可用固相的例子有微孔板（通常是聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯）、小管和珠子。小管和珠子通过提供较低的检测限来扩展测定参数。这是因为它们允许灵活的测试数量和测定体积，同时还为涂层和反应的发生提供更大的表面积。珠子的使用可以进一步减少孵育时间，并使 ELISA 能够用于不同的微流体系统，即自动化台式 ELISA。珠子本身可以是磁性的，因此使用磁铁可以轻松地将其分布在整个液相中。

样本：

应选择具有已知分析物浓度的标准样品，以涵盖从检测下限到上限（校准）的整个测定范围。这是为了确保无论样品中可测量的分析物浓度较低还是较高，测定的灵敏度和精确度都是一致的。此外，患者样本应取自并包含各种年龄范围、种族、性别和健康状况，以确保检测的广泛适用性和可靠的结果。在定量之前和定量过程中保持目标分析物稳定对于准确测定浓度至关重要。因此，样品提取、制备和储存中涉及的以下分析前条件尤其重要。

  • 必须选择能够保持分析物稳定性的适当样品基质。

  • 可能需要将蛋白酶抑制剂添加到生物流体样品基质中，以防止天然存在的蛋白酶降解分析物。

  • 收集患者样本时，必须评估运动、禁食、酒精、烟草和季节变化的影响。

  • 必须确定最佳样品储存温度（-80° C、-20° C、2-8° C 或室温）和冻融循环次数

  • 必须研究样品在室温下放置并在检测环境中保持稳定的时间长度。 

  • 移液前必须以标准化方式充分混合或倒置样品，以确保分析物在整个样品基质中均匀分布。

洗涤缓冲液

洗涤缓冲液的目的是洗掉任何未结合或过量的物质，否则可能会产生背景噪音信号并干扰测定和结果。洗涤缓冲液的设计具有与生理条件相似的 pH 值和盐浓度，并含有TRIS ( FT15751 )、PBS 和聚山梨酯等洗涤剂。如果检测到大量“背景噪音”而不是信号强度，则增加洗涤缓冲液的体积、洗涤剂的浓度或/和洗涤步骤的数量通常会有所帮助。这将增加所有未结合材料被去除的可能性。如果怀疑分析物降解或者分析物在程序中被洗掉，则减少洗涤步骤数、洗涤缓冲液体积或缓冲液中去污剂的浓度可能是有益的。

封闭缓冲液

为了防止与其他检测成分发生交叉反应和非特异性抗原结合，需要使用封闭剂。通常将牛奶溶液（脱脂奶粉）、全血清或牛血清白蛋白 (BSA) ( PRO-422 ) 等试剂添加到缓冲液中，并在第一次洗涤步骤后使用，以饱和孔的自由表面。

这种封闭缓冲液也可以含有去污剂，但应避免使用可能干扰测定的生物素或免疫球蛋白等成分。总体封闭缓冲液可以获得更高的信噪比，并且可以在使用的封闭剂的体积、浓度和类型方面进行优化。

酶和底物（信号系统）

常用的信号系统之一是酶联抗体，并且有多种不同形式和物种类型可供选择。常用于 ELISA，其中碱性磷酸酶和磷酸对硝基苯酯底物在目标分析物存在的情况下会产生黄色。检测抗体还可以与过氧化物酶并与氨基水杨酸和邻苯二胺底物一起使用，如果出现阳性结果，它们会呈现棕色。总体酶反应用于证明反应的特异性和速率。信号出现后，可以添加氢氧化钠、盐酸或硫酸来终止反应。 

在测定开发过程中，性能和财务方面在确定应使用哪些试剂以及浓度时起着关键作用。虽然使用较低浓度的酶联抗体可能更具成本效益，但可能有必要增加浓度以确保产生足够的信号强度。如果您的 ELISA 灵敏度较差，可以通过改变抗体类型（从单克隆抗体到多克隆抗体）或采用不同的信号系统来放大信号。第一个例子是二抗被生物素化，然后添加链霉亲和素-HRP。由于四个链霉亲和素分子可以与生物素相互作用，因此通过添加更多的链霉亲和素分子进行检测，可以提高检测少量分析物的能力。此外，通过用多种酶、银纳米颗粒标记检测抗体或使用化学发光或荧光底物等替代底物类型，可以提高灵敏度。 

校准和控制

标准曲线或校准曲线由分布在测定范围内的已知分析物浓度的样品组成。它们在 ELISA 中用作辅助，以便稍后计算目标分子的浓度。应该强调的是，校准品和对照品的矩阵应尽可能与所运行的天然样品的矩阵相似。

运行标准曲线很有用，如果生成的标准曲线较差，可能会导致结果无效或突出检测中的错误。不正确的抗体结合或分析物捕获可能是标准曲线不良的原因。除了校准曲线外，还应使用阳性和阴性对照样品。阴性对照不应包含任何感兴趣分析物的痕迹，因为它们用于检查假阳性和非特异性结合。阳性对照应含有已知浓度的目标分析物。如果测定检测到阳性对照中存在分析物并且阴性对照均为阴性，则测定工作可靠且结果有效。


如何进行ELISA的构建？

使用已知浓度的校准品创建的 ELISA 标准曲线示例，X 表明通过曲线插值获得的未知样品的浓度。

培养箱和混合器

尝试并使用 ELISA 的特定孵育时间和温度，有助于在捕获抗体和目标分析物之间达到结合平衡。控制板周围温度的一种方法是使用确保波动最小的培养箱。此外，使用混合器可以帮助您的 ELISA 达到最佳性能，因为它有助于将试剂分布在整个基质中，以促进更多的结合。一般来说，较长的潜伏期可能有利于灵敏度，因为有更多的时间进行结合。然而，还应该测试缩短的孵育时间。

捕获抗体的固定化方法

当捕获抗体固定到 ELISA 板上时，其方向可能会发生变化，从而降低其亲和力以及与抗原结合的机会。此外，洗涤步骤中抗体的置换可能导致灵敏度和重现性较差。解决这个问题的一种方法是使用单层表面，使抗体能够共价结合到板上，但 Tania García-Maceira 等人已经证明了灵敏度的更大改进。 （2020）通过使用甲壳素涂层的聚苯乙烯表面来实现。使用这种固定形式，抗体通过与几丁质结合域融合，以更好的方向被捕获到微量滴定板上。

哪些因素可能会影响到高锰酸盐指数的测定

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哪些因素可能会影响到高锰酸盐指数的测定

　　高锰酸盐指数是反映水体中有机和无机可氧化物质污染的常用指标，定义为：高锰酸盐指数是反映水体中有机和无机可氧化物质污染的常用指标，定义为：在一定条件下，用高锰酸钾氧化水样中的某些有机物及无机还原性物质，由消耗的高锰酸钾量计算相当的氧量。
　　高锰酸盐指数在测定时必须严格遵守操作规定，使监测结果具有准确性、可比性。在实际工作中，通过对已知浓度的环境标准样品进行测定，发现影响高锰酸盐指数准确性的重要因素有：水浴加热时间、滴定时间、空白值(蒸镏水存放时间)、高锰酸钾溶液浓度、样品酸度等。
　　1、水浴加热的时间影响
　　高锰酸盐指数测定值随水浴加热时间的延长而增大,在(30±2)min 的范围内符合不确定度的要求，加热时间30min 的测定接近真值。因此在日常监测时，应尽量使加热时间统一为30min，这样可以提高数据的准确度。
　　2、滴定时间的影响
　　从沸水浴中取出锥形瓶时的温度可达93℃，但加入草酸钠温度下降了16℃；滴定过程只用了1min, 温度却又下降了11℃，达到66℃。与反应温度下限只差6℃；滴定结束后在放置3min，温度降至60℃。由此可见，滴定过程必须自加热结束起快速进行，争取在3min 内结束滴定，不能超过6 min。
　　3、蒸馏水空白值的影响
　　标样测定值随着空白值的增大而增大，当空白值为0.60 mg/ L (即蒸馏水存放时间为5 天)时,测定结果已接近不确定度的上限,而空白值超过0.85 mg/ L (即蒸馏水存放时间超过10 天)时,测定结果已超出不确定度的上限。因此，在测定高锰酸盐指数时，不要使用存放时间超过5 天的蒸馏水，最好取用新鲜蒸馏水，这样就可以减少空白值对测定结果的影响。
　　4、高锰酸钾溶液浓度的影响
　　当K值较小即高锰酸钾溶液浓度过低时，空白消耗量偏大，使测定结果偏低；当K 值较大即高锰酸钾溶液浓度大于0.0100 mol/L时，空白消耗量为0 mL，空白实验无法完成。所以在测定样品前首先要将高锰酸钾溶液浓度调至≤0.0100 mol/L，越接近理论值越好。
　　5、样品酸度的影响
　　样品酸度的影响高锰酸盐指数测定是在酸性条件下(加硫酸，使pH<2), 用高锰酸钾将样品中的某些有机物及还原性物质氧化。
　　只有当在一定的硫酸介质中[H+]为0.5~1 mol/L时,滴定终了时应为0.2~0.5 mol/L 左右，这时高锰酸盐指数测定结果才接近真值。酸度过低，KMnO4 会部分被还原为MnO2 沉淀，酸度过高则会促进H2C2O4 分解。
　　高锰酸盐指数是地表水、水源水、生活污水中的重要监测项目，也是我国地表水污染程度评价的重要指标之一。结果表明，手动操作测定该指标具有一定相对性，受操作员经验和自身认知判断影响，样品的保存、空白值、酸度、水浴的加热时间、滴定过程、滴定温度等因素一致性难以保证，这会造成数据可靠性与一致性较差。并且人工手动操作时，且每一步的操作过程耗时较长，对实验员操作要求较高。
　　6、所取水样体积
　　本标准测定范围较低，为 0.5~4.5 mg/L，只适合清洁水质的测定；对污染较重的水，可少取水样，经适当稀释后测定。由试验结果可知，取样量过小，氧化剂相对比较大，使测定结果偏高；取样量过大时，消耗了一定的氧化剂后，使溶液的氧化能力减弱，导致测定结果偏低。所取水样体积要求在回滴过量的Na2C2O4 标准溶液时所消耗 KMnO4 溶液的体积最好在 4~6 mL 左右，如果消耗体积过大或者过小，需重新再取适量水样测定。
　　7、滴定过程
　　高锰酸钾法滴定过程需要把握好试样的温度、滴定速度和时间以及终点观察。
　　8、滴定温度
　　高锰酸钾对草酸钠进行氧化主要是一个吸热反应的过程，温度越高，反应的速度也会加快。用高锰酸钾滴定剩余的草酸钠时，滴定温度要求在 60~80 ℃之间。当反应温度超过 90 ℃ 时，草酸钠容易分解: 2H+ +C2O24- = CO2↑+CO↑+H2O，使溶液呈现茶色，应在从沸水浴中取出后将溶液稍微放置，再加入草酸钠；当反应温度低于 60 ℃时，高锰酸钾与草酸钠的反应速度缓慢，则会影响氧化反应的程度。
　　9、滴定速度
　　滴定过程应采用慢-快-慢的滴定速度，一开始不易过快，否则高锰酸钾溶液会发生部分分解，影响结果准确性。滴定时间应控制在 2 min 内完成，时间过长会使试样温度下降，使测定结果偏高。
　　10、终点观察
　　当滴定反应进行到终点时，稍过量的 MnO4-都可使水样呈现淡淡的粉红色，但由于颜色很淡，很容易滴加过量导致结果偏高。根据试验实际操作经验，在滴定时可以把锥形瓶置于白纸上或自制的带有凹槽的泡沫板中，这样更容易观察到滴定终点颜色变化。滴定终点应为粉红色，并保持30s不褪色。

脂联素测定DZ188A

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脂联素测定

简要描述：脂联素测定，产品型号：DZ188A。
规格：R1 / R2（双瓶液体稳定）
方法：双瓶液体稳定，免疫比浊法

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品牌 其他品牌 供货周期 一个月
应用领域 医疗卫生,环保,化工,生物产业,综合

脂联素测定，产品型号：DZ188A 。

脂联素测定，描述：


产品特点

用于测定血清中的总脂联素浓度。该测定的线性范围为1.12-40mg / L，并且具有≤4.9％的运行内和运行间精密度CV。研究表明，脂联素表达下降与胰岛素抵抗相关。脂联素似乎是连接脂肪组织和全身葡萄糖代谢的有效胰岛素增强剂。

预期用途

Diazyme Adiponectin Assay用于乳胶增强免疫比浊法测定血清中总脂联素浓度。仅供美国研究使用

上海金畔生物科技有限公司

  1. 国内试剂耗材经销代理。

  2. 国外试剂的订购。可提供欧美实验室品牌的采购方案。

  3. 提供加急物流处理，进口货物，最快交期1-2周。

  4. 进出口货物代理服务。

  5. 公司代理众多有名生命科学领域的研究试剂、仪器和实验室消耗品品牌：CELL DATA,Alamanda Polymers， cstti，Click Chemistry tools，Nanoprobes，Ancell，NANOCS，Ambeed, Inc，SPEED BioSystems, LLC，Tulip Biolabs, Inc，Torrey Pines Biolabs，magsphere ,FabGennix International ,paratechs，Medicago,Oraflow,CWE,Wasatch Photonics, alphananote, It4ip, proteoform, Caprico等,重点合作品牌 Lee Biosolutions,chematech,Nanopartz,denovix,Atto tec,macrocyclics等。

  6. 质量保证，所有产品都提供售后服务。付款方式灵活。公司坚持“一站式”服务模式，为客户全面解决实验、生产、开发需求。公司整合国际与国内资源，加强网络建设，提高公司内部运作效率，为客户提供方便、快捷的服务。

1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）测定DZ152A

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1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）测定

简要描述：1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）测定，产品型号：DZ152A。
规格：R1 / R2（双瓶液体稳定）
方法：双瓶液体稳定，酶法

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品牌 其他品牌 供货周期 一个月
应用领域 医疗卫生,环保,化工,生物产业,综合

1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）测定，产品型号：DZ152A 。

1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）测定，描述：


产品特点：

1,5-AG反映了在前1-2周内高于肾阈值的高血糖，这与HbA1c和糖化血清蛋白测定相互补充。该测试为患者最近的高血糖偏移提供了有用的视角，这在标准血糖标记中可能并不明显。高血糖偏移可能与血糖变异性相关，可通过更频繁的血糖自我监测（SMBG）或连续血糖监测（CGM）来研究。

预期用途

测定是用于定量测定血清或血浆中脱水葡萄糖醇的酶促方法。 1,5-AG测定用于监测糖尿病患者的血糖控制的中期（1-2周之前）。仅用于体外诊断。

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D-二聚体测定DZ179A

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D-二聚体测定

简要描述：D-二聚体测定，产品型号：DZ179A。
规格：R1 / R2（双瓶液体稳定）
方法：双瓶液体稳定，
免疫比浊法

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品牌 其他品牌 供货周期 一个月
应用领域 医疗卫生,环保,化工,生物产业,综合

D-二聚体测定，产品型号：DZ179A 。

D-二聚体测定，描述：


产品特点：

是一个高度敏感的液体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，适用于多数开放生化仪，快速出结果并且成本更低。具有线性范围0.15 – 8.0μg/mL FEU，0.939的相关系数，0.979的斜率和-0.106的 y轴截距。下列物质对测定造成不大于10％的实验偏差：血红蛋白高达500mg/dL，胆红素40mg/dL，胆红素缀合为40mg / dL的，甘油三酯1000mg/dL，抗坏血酸176mg/dL，类风湿因子100 IU/mL，肝素1.5 IU / mL和HAMA 490ng/mL。

预期用途

旨在定量分析人血浆中的纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物（D-二聚体）含量。 D-二聚体检验被用作检测血管内凝血和纤维蛋白溶解的辅助手段。 仅限体外诊断使用。

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