常见细胞污染分类和污染的处理

常见细胞污染

细胞污染——培养物出现浑浊、混浊。培养液pH值升高，液黄。细胞异常的形态，如胞质内细菌吞噬体。细胞的生长速率减缓，对数生长期变得不规律。异常的细胞死亡或细胞溶解情况。

真菌污染——培养液可能出现异味。培养皿内有异常的颜色、纹理或斑点。细胞显示出不正常的细胞形态，如真菌吞噬体或真菌丝状体。细胞的生长速率可能受到抑制，细胞数量不断减少。

支原体污染——支原体污染通常不会导致明显的细胞培养液变化。因此，支原体污染通常需要PCR或DNA杂交来检测。可能出现感染迹象，如出现包涵体或囊泡。细胞的生长速率减缓。

常见污染处理

因污染会改变细胞表型，在细胞种子充足及排除污染因素的情况下，首先丢弃污染细胞，重新复苏。

在未检测的情况下沿用当前细胞试剂及耗材可能导致污染扩散，应及时灭菌或丢弃。

如果怀疑细胞培养受到污染，应立即采取行动来确认并解决问题。常见的处理方法包括：

1.隔离：将受污染的培养物隔离，并最后处理污染细胞，以防止污染蔓延到其他培养物中。

2.污染源排除：查找和消除污染的来源，可使用无抗LB摇菌培养或污染检测试剂。

3.更换培养液：将受污染的培养液更换为新的培养液，细菌污染添加敏感抗生素如氨苄青霉素，真菌添加两性霉素B，支原体添加氧氟沙星以控制污染。

4.细胞重新传代：如有必要，将细胞重新传代到新的培养皿中，离心速度低于平时，200-300g。

5.污染检测：进行污染检测，以确认污染的类型和程度，从而采取适当的措施。

操作手册

● 原代细胞提取

● 血清更换注意事项及步骤

● 血清储存及化冻

● 持续更新中

原代细胞提取-1

固体组织样品（肝，肺，肿瘤等）

1.分离组织后立即移入超净台操作（＜20min)，或放入组织保存液中四度保存（不超过48h)。

注意：以下步骤均需无菌操作，且保持低温！

2.取一无菌小皿，加入3ml预冷的PBS，放入组织清洗。重复此步骤一次。

3.用无菌剪和无菌镊（高温高压灭菌）去除脂肪或坏死区域等非目标组织。

4.转移组织块至一无菌15ml/50ml离心管中，加入组织体积10倍的advanced DMEM/F12培养基（缓冲液可自行调整，与后续培养体系一致）。离心管置于冰上，用无菌剪将组织剪成肉泥状。（此步骤注意低温）

5.四度600g离心5分钟，去上清，加入消化液（浸没组织），37℃摇床（800rpm)消化15min，视解离状态调整消化时间，一般不超过45min。（消化液需视组织类型自行调整。一般组成为胶原酶1和4，浓度为400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可选择添加10uM ROCK抑制剂以提高组织活率。）

原代细胞提取-2

6.消化结束立即冰上，加入体积6%的血清终止消化，四度离心弃上清，用巴氏管吸取1-2ml全培养基重悬后细胞滤网过滤，根据后续目的和细胞类型选择滤网大小（类器官需要细胞团一般选择较大的100um，建库的单细胞悬液一般选择70um或更小）。

7.视上一步沉淀颜色选择是否裂红，裂红至沉淀无明显红色即可。裂红液现配，至少10ml，常温避光裂红10min。

8.用巴氏管充分混匀细胞悬液，吸取10ul细胞悬液与2x台盼蓝混匀后计数板计数。一般细胞活性＞85%为达标。如不达标，则低速(200-300g)四度离心后弃上清，重悬，再次计数和测量活性，直至达标。）

9.计算所需细胞数量并进行下一步操作，直接种板培养，点胶，或上机等。

液体样品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度离心5min后弃上清，用medium重悬清洗两次。

2.过滤可选，直接进入裂红判断步骤

3.后续步骤同上。

微生物培养的污染因素及预防方法

随着现代生物学研究的发展，微生物培养成为了重要的实验手段之一。然而，在进行微生物培养过程中，存在着许多污染因素，这些污染因素可能会对实验结果产生影响或者导致实验结果不准确。下面将介绍一些常见的微生物培养的污染因素以及相应的预防方法。

1.培养箱内的风速和风向对于保持温度的均一性以及避免污染都非常重要。一般来说，适当的风速和风向可以帮助培养箱内的温度保持均一，有利于微生物的正常生长。然而，当风速过大时，可能会导致培养基干裂，从而影响培养结果的准确性。另外，药典要求培养皿倒置培养，这是因为经过多次验证发现，当培养箱运行时的风向与培养皿盖的朝向不一致时，容易引入空气中的灰尘、杂菌等，从而污染培养物。因此，在使用培养箱的过程中，需要注意风速和风向的控制，并尽量与培养皿盖的朝向一致。

2.培养皿由平底和盖组成，一些微生物实验室常用的培养皿直径为90mm，采用顶盖封装。然而，由于不同厂家制造的培养皿的成型工艺和参数不同，平底和盖之间的间隙也存在差异。这些间隙虽然能够满足需氧型微生物对氧气的需求，但也增加了污染的可能性。经过实验证实，在同样的培养条件下，间隙大的培养皿比间隙小的培养皿更容易受到污染。此外，间隙的大小不同还会导致培养皿内培养基的水分蒸发不一致，从而影响培养结果数据的一致性。因此，在使用培养皿的过程中，需要选择质量可靠的培养皿，并注意平底和盖之间的间隙情况。
3.微生物生长需要一定的湿度条件。湿度对微生物生长的影响是通过影响微生物细胞内水分活度进而影响其新陈代谢来实现的。不同微生物的生长对湿度有一定的要求，一般来说，细菌最为敏感，酵母和霉菌次之。降低湿度会使微生物的水分活度降低，从而减慢其生长速度。因此，在微生物培养的过程中，需要保持适宜的温度和湿度，以有利于微生物的生长。培养箱内湿度的来源主要有培养基的水分散失、湿度自动调控系统以及培养箱所在的环境。因此，在使用培养箱的过程中，需要控制湿度，保持适宜的生长环境。

4.培养物溢洒是指含有生物危险物质的液体或固体物质意外与包装材料分离的过程。一旦发生生物危害物品的溢出，尤其是含病原微生物的培养物的溢出时，会导致微生物的生长和繁殖，从而引起培养箱的污染。为了预防交叉污染，当发生培养物溢洒时，需要及时清理和消毒培养箱。应该使用有效的消毒剂对培养箱的内壁以及接触溢出物品的材料进行消毒或高压灭菌。此外，如果溢洒物中含有破碎的玻璃等材料，不得直接用手取走或弃置，应该使用硬纸板和镊子等工具处理，并将处理物放置在安全的废弃物容器中。最后，对清洁工具也需要进行消毒处理，以确保卫生安全。

5.培养箱需要放置在洁净、干燥、通风良好的自然环境中。如果环境中空气洁净度不够高，容易滋生细菌、真菌和病毒等微生物，并通过平底和盖之间的间隙污染培养基，从而影响培养结果数据的准确性。因此，在使用培养箱的过程中，需要注意放置环境的卫生和通风状况，尽量避免自然环境的污染。

综上所述，微生物培养过程中存在着多种污染因素，这些因素可能会对实验结果产生影响或导致实验结果不准确。为了保证实验结果的准确性，需要在使用培养箱进行微生物培养时，注意控制风速和风向、选择合适的培养皿、控制湿度、避免培养物溢洒以及注意自然环境的卫生状况。只有这样，我们才能够获得可靠且准确的微生物培养结果。