用内质网染色剂对活细胞进行染色 LumiTracker ER
LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 具有细胞渗透性，对内质网 (ER) 染色剂具有高度选择性，可用于活细胞成像。两种 ER 染色剂都是 BDP 染料与格列本脲（格列本脲）偶联的衍生物。格列本脲与 ATP 敏感钾通道 (K ATP ) 的磺酰脲 (SUR) 受体结合，该受体在内质网上很突出。
用甲醛固定后，染色部分保留。 LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 不适合对固定后的细胞进行染色。
注意：格列本脲的药理活性可能会影响 ER 功能。某些特殊细胞类型中磺脲类受体的可变表达可能会导致非 ER 标记。
溶液的制备
1.1 库存溶液的制备
-
将 50 μg LumiTracker ER Green 溶解在 64 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。
-
将 50 μg LumiTracker ER Red 溶解在 55 μL DMSO 中，以获得 1 mM 储备溶液。
注意：我们建议将储备溶液储存在−20°C或−80°C避光条件下。避免反复冻融循环。
1.2 工作液的配制
用钙和镁 (HBSS/Ca/Mg) 在 Hank's 平衡盐溶液中稀释 LumiTracker ER 染色剂的储备溶液，以获得工作溶液。使用 100 nM 至 1 μM 的浓度。 LumiTracker ER 染色剂的稀释度取决于细胞类型和密度，应通过实验确定。
细胞染色
2.1 悬浮细胞染色
-
1000 g离心细胞悬液 3-5 分钟；弃去上清液。
-
用预热的 HBSS 在 37°C 下清洗细胞两次，每次 5 分钟。
-
推荐的细胞密度为1×10 6 个细胞/mL。
-
将 1 mL 预热的 LumiTracker ER 工作溶液添加到管中，并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育细胞 15-30 分钟。
-
室温下以 400 g离心细胞 3-4 分钟；弃去上清液。
-
用培养基清洗染色细胞两次。
-
用无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞。
-
通过流式细胞仪分析细胞。
-
对于荧光显微镜，将一滴染色的细胞悬浮液转移到载玻片上。用盖玻片盖住细胞。
2.2 贴壁细胞染色
-
在无菌盖玻片上培养细胞。
-
贴壁细胞可以直接在盖玻片上染色。
-
从盖玻片中吸出介质。
-
用 37°C 预热的 HBSS 冲洗细胞。
-
加入 100 μL 预热的 LumiTracker ER 工作溶液，轻轻摇动以全覆盖细胞。在 37 °C 和 5% CO 2下孵育细胞 15-30 分钟。
-
用培养基清洗染色细胞两次。
-
如果通过流式细胞术检测，则需要在染色前重悬细胞。
-
对于荧光显微镜，将带有染色细胞的盖玻片翻转到载玻片上，将它们放置在载玻片和盖玻片之间。
细胞固定
-
如果要固定染色的细胞，请在 4% 甲醛中于 4 °C 下孵育 2 分钟。
-
固定细胞用 PBS 清洗两次，每次 5 分钟。
-
使用封固剂将细胞封固在盖玻片下 。
