什么是蛋白质印迹？

蛋白质印迹是研究蛋白质结构和功能的常用技术。通常，蛋白质样品在 SDS 凝胶上进行电泳，然后转移到固相支持物（硝基纤维素或 PVDF 膜）上，以便随后用特异性抗体进行探测。与 RNA/DNA 印迹技术的进步不同，剥离抗原/抗体并重复使用印迹是很困难的。

印迹的回收具有许多优点：

• 有效利用数量有限的样品。

• 比较在同一印迹中使用不同抗体获得的图像。

• 使用相同或不同的抗体确认结果。

• 重复使用印迹更加经济且耗时更少。

重复使用蛋白质印迹的想法源于这样的事实：抗原-抗体复合物（例如，免疫亲和柱）可以被破坏并且免疫亲和柱可以多次重复使用。然而，免疫亲和技术中常用的洗脱条件（低或高 pH、使用离液剂）并不能有效地从蛋白质印迹中剥离抗体。

ADI 现在开发了专门配制的解决方案，可以在温和的条件下有效且几乎定量地剥离抗体。它具有以下优点：新型抗体条解决方案的优点

1. 1. 室温剥离抗体（无需加热）。
2. 2.无刺激性气味，巯基乙醇。
3. 3. Strip 溶液为 10X 溶液，可立即使用。只需将印迹浸泡在溶液中 10-15 分钟即可。
4. 4. 在封闭缓冲液（试剂盒中提供）中短暂孵育后，印迹可在 15-60 分钟内重复使用。

蛋白质印迹 (WB) – 实验方案

蛋白质印迹是一种常用的分子生物学技术，用于分析样品中感兴趣的蛋白质。细胞裂解物由细胞培养物裂解产生，并在凝胶电泳 (SDS-PAGE) 中按重量分离。然后这些蛋白质从凝胶转移到膜上，在膜上它们被封闭并用特异性抗体探测以检测感兴趣的蛋白质。借助灵敏且特异的抗体，可以轻松检测小样品中的修饰蛋白质或未修饰蛋白质。

协议：

1. 在封闭液（TBST 中的 5% 脱脂牛奶（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.6）中振荡孵育 1 小时，封闭膜。

注意：对于磷酸化特异性抗体，使用封闭液中的 5% BSA。

2. 在封闭液中以适当的稀释度稀释一抗。

3. 将膜与稀释的一抗在 40°C 下搅拌孵育过夜。

4. 去除抗体溶液。室温下在 TBST（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6）中摇动洗涤膜 3 次，每次 5-10 分钟。

注意：将 Tween-20 浓度增加至 0.1% 可降低背景并提高特异性，但会降低灵敏度。

5. 将膜与在封闭液中稀释（根据制造商说明）的二级 AP 或 HRP 缀合物一起在室温下振荡孵育 1 小时。

6. 按照步骤 4 清洗膜。

7. 在进行化学发光反应之前，用 TBS 清洗膜 2-5 分钟。

8. 根据制造商的说明制备和使用化学发光底物（用于 AP 或 HRP）。

9. 立即包裹膜并在 X 射线胶片下曝光 10 秒至 1 小时。暴露时间可能根据抗体和抗原的量而变化。或者放入成像仪中并进行相应调整。

定量蛋白质印迹介绍

什么是定量蛋白质印迹？

蛋白质印迹用途

• 蛋白质-蛋白质相互作用

• 信号通路

• 翻译后修饰

• 细胞表面蛋白

• RNAi分析

为什么我们需要定量蛋白质印迹？

呈现最佳印迹

定量蛋白质印迹要求

什么是可变性？