肽标记策略
肽标记策略
标记肽可以通过修饰分离的肽或在固相合成过程中结合标记来制备。用荧光团标记肽的常用策略包括:
肽合成过程中的标记-可以耐受解封闭程序的染料可以结合到肽链的氨基末端。
2.N端修饰:N端是指蛋白质或多肽链起始处的游离胺基（-NH2）。可以使用胺反应性琥珀酰亚胺酯荧光团对其进行共翻译修饰或翻译后修饰。
3.赖氨酸残基:赖氨酸残基的ε-氨基可以用胺反应性琥珀酰亚胺酯荧光团修饰。
4.C端修饰:C端是指蛋白质或多肽链末端的羧基（-COOH）。它可以在翻译后进行修饰，通常是在C端酰胺化之后。
5.如果肽链上有半胱氨酸，巯基反应蛋白标记可以共价标记合成肽。
6.非天然氨基酸可以在合成过程中结合到肽链中，然后通过生物正交反应（例如基于叠氮化物和炔烃的反应以及酮醛反应）用染料或其他探针标记。
含有伯氨基的生物分子的 NHS 酯标记介绍
常见的修饰是荧光标记、荧光猝灭剂和其他报告基团。可以使用活化酯连接炔烃和叠氮基，以使生物分子适应点击化学。
尤其常见的是蛋白质和肽的修饰，因为它们几乎总是含有氨基。其他例子是氨基寡核苷酸的修饰、氨基修饰的DNA和含氨基的糖。
NHS 酯与氨基的反应强烈依赖于 pH 值：在低 pH 值下，氨基被质子化，并且不会发生修饰。在高于最佳 pH 值时，NHS 酯的水解速度很快，并且修饰分子的产率会降低。改性的最佳pH值为8.3-8.5。
水是用于溶解 NHS 酯以进行生物分子标记的常用溶剂。如果NHS酯难溶于水溶液，可首先将其溶解在 二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后添加到pH 8.3-8.5缓冲液中的蛋白质溶液中。请注意，DMF 可以降解为二甲胺，二甲胺具有鱼腥味，并且能够与活化酯发生反应。因此，标记生物分子时，使用不含二甲胺、无鱼腥味的高质量DMF非常重要。
使用下面的公式或我们的蛋白质标记计算器计算所需的 NHS 酯量：
NHS_酯_重量 [mg] = 8 × 氨基_化合物_重量 [mg] × NHS_酯_摩尔_重量 [Da] / 氨基_化合物_摩尔_重量 [Da]。
8是摩尔过量的NHS酯。它是单标记的经验值，适用于许多常见的蛋白质和肽。然而，在某些情况下，使用更少或更多的 NHS 酯可以增加修饰生物分子的产量。它取决于蛋白质结构、标记所用试剂及其溶解度。 Lumiprobe 产品的摩尔重量可以在相应的产品页面上找到。
例如，要使用 Cy5 NHS 酯（摩尔量 616 道尔顿）标记 3 mg BSA（摩尔量 66500 道尔顿），并获得单标记产物的最大产量，应使用 8 × 3 mg × 616 Da / 66500 Da = 0.22 毫克 Cy5 染料 NHS 酯。
计算反应混合物的体积。标记反应中的最佳生物分子浓度为1-10 mg/mL。标记可以在任何规模上进行，从纳摩尔到几十克。如果标记少量生物分子，请将反应混合物的体积保持在低水平 (10-20 uL)。
将 NHS 酯溶解在 1/10 反应体积的水、DMF 或 DMSO 中。不含二甲胺的DMF或水是优选的溶剂。溶解在 DMF 中的 NHS 酯可在 -20°C 下在溶液中保存 1-2 个月。 NHS酯的水溶液配制后应立即使用。
将生物分子溶解在 9/10 反应体积的 pH 8.3-8.5 缓冲液中。
0.1 M 碳酸氢钠溶液具有适当的 pH 值。另一种选择是 0.1 M 磷酸盐缓冲液。请注意，pH 值是成功用 NHS 酯标记生物分子的最重要因素。避免使用含有胺的缓冲液（有时可以使用基于 Tris 的缓冲液，但不推荐使用。Tris 含有氨基，但对活化酯的亲和力较低）。
在进行大规模标记（使用数百毫克 NHS 酯）时，请注意，由于 NHS 酯的水解，混合物会随着时间的推移而酸化。监测 pH 值，或使用浓度更高的缓冲液。
将 NHS 酯溶液添加到生物分子溶液中，并充分涡旋。在冰上放置过夜，或在室温下放置 1 至 4 小时。
使用适当的方法纯化缀合物：大分子凝胶过滤是最常见的。色谱法是另一种选择。对于蛋白质和核酸，可以使用乙醇或丙酮沉淀。有机杂质（如 N-羟基琥珀酰亚胺、NHS 酯和水解产生的酸）几乎总是可以通过这些方法轻松分离。
炔烃修饰的寡核苷酸与染料叠氮化物的缀合
点击化学缓冲液适用于含有炔烃的寡核苷酸的合成后缀合。带有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亚磷酰胺合成，或者您也可以在我们的网站上订购修饰寡核苷酸的合成。
叠氮化物与修饰寡核苷酸的末端炔缀合，形成五元杂环。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。
该反应在铜 (I) 存在下、中性 pH 值下进行。催化缓冲液含有铜 (II)、醋酸三乙铵 pH 7 和 DMSO。建议使用新配制的 抗坏血酸溶液来还原铜 (II)。
对于此反应，您将需要炔烃修饰的寡核苷酸、叠氮化染料、点击化学缓冲液和抗坏血酸。您可以在我们的网站上在线订购所有试剂。
我们推荐以下方案用于含炔寡核苷酸与叠氮化染料的缀合：
根据要使用的寡核苷酸的量确定总反应体积：
| 寡核苷酸的量 | 总反应体积，μL |
|---|---|
| 4至20纳摩尔 | 100 |
| 20至40纳摩尔 | 200 |
| 40至80纳摩尔 | 400 |
| 80 至 600 纳摩尔 | 600 |
使用下表计算标记反应的试剂体积：
| 试剂 | 体积，微升 | 原液浓度 |
|---|---|---|
| 叠氮化染料 | (寡核苷酸量[nmol])×0.15 | 10 mM DMSO 溶液 |
| 点击化学缓冲液 | （总反应体积[μL]）×0.67 | 1.5倍 |
| 活化剂 （抗坏血酸） |
（总反应体积[μL]）×0.02 | 50 mM 水中 |
| 水（用于溶解寡核苷酸） | （总反应体积 [μL] – 叠氮化染料溶液的体积 [μL] – 缓冲液的体积 [μL] – 活化剂溶液的体积 [μL]） | — |
准备叠氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化剂（抗坏血酸，水中 50 mM） 的储备溶液 。
请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液（该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。
将寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 计算体积的 水中。
添加点击化学缓冲液和涡旋。
添加计算体积的叠 氮化染料储备溶液并再次涡旋。
（受到推崇的）。将混合物脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气、氮气或氦气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流并将头部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将头部保持在该位置 10-20 秒。
如果同时运行多个标记反应，则可以使用 SpeedVac 型系统进行脱气。为此，将管子放入系统中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端注入惰性气体。
添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。
涡旋溶液。如果反应过程中形成沉淀，请将管在热水 (70–95 °C) 中加热，直至沉淀溶解并涡旋溶液。
让混合物在室温下静置 8-16 小时。
添加 2M 高氯酸锂溶液（每 5 体积的反应混合物 1 体积），涡旋溶液，并添加额外的纯丙酮至 2 mL。
摇动管子并使其在-20°C 下静置 20 分钟。
以 10,000 RPM 离心 10 分钟，分离沉淀物。丢弃上清液。
将 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。摇动管数次，并以 10,000 RPM 离心 10 分钟分离沉淀物。丢弃上清液。
让沉淀物在室温下在开口管中干燥 1 小时或将管放入 65°C 的加热块中 10 分钟。
将沉淀物溶解于水中，并通过HPLC纯化目标产物
聚乙二醇 (PEG) 对制药行业的重要性
聚乙二醇（PEG）是一种安全、无活性、无毒的聚合物，常用于分子修饰。用聚乙二醇修饰蛋白质的治疗益处包括减少肾脏和细胞清除率以及延长半衰期；增强对蛋白水解的保护；并降低毒性。生物活性蛋白聚乙二醇化的目的是改善其药代动力学和药效学特性，同时保留天然蛋白的内在生物活性。为了提高药理活性和临床疗效，需要对聚乙二醇蛋白的药代动力学和药效学进行优化，而PEG聚合物链的结构、长度、分子量和修饰方法都是影响优化的因素。
聚乙二醇修饰，又称分子聚乙二醇化，是20世纪70年代末发展起来的一种修饰方法。活化的聚乙二醇与蛋白质分子偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质的各种生化性质发生变化：化学稳定性增加，抗蛋白水解能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，半衰期延长。体内时间延长，血浆清除率降低。
聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能与水形成氢键，因此具有良好的水溶性，可溶于除己烷、乙二醇外的大多数有机溶剂。大多数蛋白质经过聚乙二醇修饰后，除了保留或增加其水溶性外，还可以获得在某些有机溶剂中的溶解度。在蛋白质溶液中，聚乙二醇，无论是游离形式还是结合形式，即使在高浓度下也不会对蛋白质分子产生不利影响。聚乙二醇修饰的蛋白质的一般构象没有改变，缀合物的生物活性主要由缀合物的蛋白质部分产生。
近年来，蛋白肽、天然产物药物分子等生物大分子药物越来越多地应用于疾病治疗领域，极大地推动了医药行业的发展。但生物大分子因其半衰期短、易产生免疫原性抗原性、易酶解以及一定的药理毒性等原因，在药用过程中的作用受到很大限制。为了有效解决这一问题，通过用聚乙二醇对药物分子进行化学修饰来达到延长药效的目的。由于聚乙二醇链的空间位阻，修饰后的蛋白质对蛋白酶水解的抵抗力大大提高，修饰后的分子的分子排除体积显着增加，从而使肾滤过率显着降低。同时，聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，可以降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其很难被免疫系统识别和清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，并能降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被识别并被免疫系统清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，并能降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被识别并被免疫系统清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。
聚乙二醇（PEG）接头通常具有较好的水溶性和较低的免疫原性。它们广泛应用于 ADC 生物共轭研究。PEG 连接子为研究界提供了改善生物共轭复合物的理化性质的强大工具。
AxisPharm 有超过 5,000 种高纯度 PEG 试剂库存。长度和功能的广泛选择将为制药和生物技术研发的聚乙二醇化、生物共轭、交联、ADC 药物开发以及生物标记提供支持。
AxisPharm 提供一系列基于 PEG 的试剂，具有不同的接头长度，带有各种反应基团。如mPEG、 PEG酸、PEG胺、PEG叠氮化物、马来酰亚胺PEG、NHS酯PEG、溴化PEG等。
什么是聚乙二醇（PEG）改性？
聚乙二醇（PEG）修饰是带有官能团的聚乙二醇，主要用于蛋白质药物修饰，以增加体内半衰期，降低免疫原性，同时增加药物的水溶性。
聚乙二醇（PEG）修饰广泛应用于药物研发，在药物缓释方面发挥着重要作用。
近年来，蛋白肽、天然产物药物分子等生物大分子药物越来越多地应用于疾病治疗领域，极大地推动了医药行业的发展。但生物大分子因其半衰期短、易产生免疫原性抗原性、易酶解以及一定的药理毒性等原因，在药用过程中的作用受到很大限制。为了有效解决这一问题，通过用聚乙二醇对药物分子进行化学修饰来达到延长药效的目的。由于聚乙二醇链的空间位阻，修饰后的蛋白质对蛋白酶水解的抵抗力大大提高，修饰后的分子的分子排除体积显着增加，从而使肾滤过率显着降低。同时，聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，可以降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其很难被免疫系统识别和清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，并能降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被识别并被免疫系统清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。聚乙二醇分子的结构特异性降低了肝脏网状内皮系统识别、摄取和清除修饰蛋白的能力，并能降低或消除诱导中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被识别并被免疫系统清除。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。这些作用使得聚乙二醇修饰的药物分子比未修饰的药物具有更好的药理和药代动力学特性。
在所有应用于改变分子结构化学的聚合物中，聚乙二醇 (PEG) 改性具有众多优点和相对较少的缺点。 PEG 现在越来越多地应用于肿瘤靶向问题，无论是在 PEG 脂质体的被动靶向还是在使用聚乙二醇化抗肿瘤抗体的主动靶向策略中。 PEG还可以充当靶向部分和其他试剂（包括细胞毒性剂或显像剂和靶向脂质体）之间的有用连接分子。尽管聚乙二醇化具有这些已证明的好处和受到的关注程度，但对两个关键领域的考虑相对较少：首先，偶联方法对聚乙二醇加合物的功能和获得的影响程度。有益的特性；第二，聚乙二醇化对生物分布的影响是复杂的，因此任何针对特定任务优化聚乙二醇肽或聚乙二醇脂质体的尝试都必须涉及对聚乙二醇化影响的所有各个方面的检查。调查肿瘤靶向基本原理的研究表明，当前关于优化肿瘤定位的聚乙二醇化载体的观点需要重新审视。
聚乙二醇化：
聚乙二醇（PEG）是一种安全、无活性、无毒的聚合物，常用于分子修饰。用聚乙二醇修饰蛋白质的治疗益处包括减少肾脏和细胞清除率以及延长半衰期；增强对蛋白水解的保护；并降低毒性。生物活性蛋白聚乙二醇化的目的是改善其药代动力学和药效学特性，同时保留天然蛋白的内在生物活性。为了提高药理活性和临床疗效，需要对聚乙二醇蛋白的药代动力学和药效学进行优化，而PEG聚合物链的结构、长度、分子量和修饰方法都是影响优化的因素。
常见修饰基团：
氨基 (-Amine)-NH2、氨甲基-CH2-NH2、马来酰亚胺-Mal、羧基-COOH、硫氢基 (-硫醇)-SH、丙醛-ALD、琥珀酰亚胺基碳酸酯-SC、琥珀酰亚胺基乙酸酯-SCM、琥珀酰亚胺基丙酸酯-SPA、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-SS、琥珀酰亚胺基-NHS、二硫代吡啶基-OPSS、丙酰基-CH2CH2COOH、醛-CHO、N-吡啶二硫代-SS-吡啶、巯基-VS、丙烯酸酯-丙烯酸酯、丙烯酸-AC、叠氮化物、生物素-生物素、环氧- EP、荧光荧光素-荧光素、戊二酰-GA、酰肼-酰肼、炔基-炔、对硝基苯碳酸酯-NPC、异氰酸酯-NCO、邻二硫代吡啶基-OPSS、甲硅烷基-硅烷、-SVA、BOC-、羧甲基-CM、Fmoc -NH-。
AxisPharm 有超过 5,000 种高纯度PEG 试剂库存。长度和功能的广泛选择将为制药和生物技术研发的聚乙二醇化、生物共轭、交联、ADC 药物开发以及生物标记提供支持。
AxisPharm 提供一系列基于 PEG 的试剂，具有不同的接头长度，带有各种反应基团。例如mPEG、PEG酸、PEG胺、PEG叠氮化物、马来酰亚胺PEG、NHS酯PEG、溴化PEG等。您可以通过以下类别了解更多信息。
AxisPharm 开发了广泛的连接子并提供定制连接子合成。我们目前的产品目录涵盖点击化学工具，如DBCO 连接器、四嗪、TCO、BCN 连接器和环丙烯等、生物素连接器、PEG 连接器、肽连接器、葡萄糖醛酸连接器、光可裂解连接器、荧光染料探针连接器（您可能需要荧光团列表））和叶酸挂钩。
作为一家以客户为导向的合同研究公司，我们提供灵活的ADC Linker产品套件和具有竞争力价格的生物共轭服务。