bellbrooklabs: DNA损伤反应介绍

bellbrooklabs: DNA损伤反应介绍

DNA损伤反应途径

DNA损伤反应检测由复制错误或外部因素引起的DNA损伤,并动员蛋白质进行修复。DNA损伤反应蛋白包括:

DNA-PK-感知双链断裂(DSB)

PARP1与DSBs结合并形成聚ADP核糖(PAR)

PARG-DNA修复后移除PAR

DSB修复中的POLQ – DNA修饰酶

WRN——DSB修复中的DNA修饰酶

DNA损伤反应过程中会发生什么? 在DNA损伤反应(DDR)途径中,发生了一系列信号事件,包括DNA损伤检测、细胞周期停滞以促进修复和DNA修复途径的激活(同源重组、非同源末端连接等)。).如果损伤不可修复,DNA损伤要么被修复,要么发生细胞凋亡。

某些DNA损伤反应蛋白负责检测DNA损伤和促进下游DNA修复机制。共济失调-毛细血管扩张症突变型(异步传输模式)在响应DNA双链断裂(DSBs)时激活,并磷酸化下游靶标以启动DNA损伤修复。依赖DNA的蛋白激酶(DNA-PK)也参与DNA DSBs的识别并启动修复机制。ATM和Rad3相关((同antitransmit-receive)反收发)在应对单链断裂和停滞的复制分叉时激活,在应对DNA复制压力中发挥重要作用。  各种传感器、信号和效应蛋白参与不同种类的DNA损伤。DNA中的单链断裂可以通过碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)或错配修复(MMR)来修复。双链断裂是最严重的DNA损伤类型,通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEF)来修复。

DNA损伤反应蛋白

双链断裂(DSB)是一种严重的DNA损伤形式,它由各种来源引起,如电离辐射或化学物质。在识别出DSB后,DNA-PK通过非同源末端连接(NHEJ)与断裂末端结合并协调下游DNA损伤修复机制。对争端解决机构的承认DNA-PK也被证明能激活I型干扰素反应。DNA-PK其作用类似于模式识别受体(PRR),通过识别DSB然后触发或改变炎症反应。

DNA损伤反应和先天免疫

DDR途径和先天免疫途径之间存在广泛的相互影响。在这里,DNA损伤剂在肿瘤细胞核中诱导DDR。dsDNA在细胞质中由细胞核或微核泄漏的DNA形成。PRRs对dsDNA的检测伴随着先天免疫反应,诱导I型干扰素和促炎细胞因子。在细胞外,腺苷(ADO)和cGAMP调节先天免疫反应;两者的水平都由胞外核苷酸酶控制。

合成致命性和癌症治疗

合成致命性是指两个基因一起出现是致命的,但这些基因单独出现是不致命的。将合成致死策略用于抗癌药物治疗已经显示出巨大的前景:DDR基因缺陷的肿瘤可以通过靶向第二种DDR蛋白的药物被选择性杀死。的使用喇叭声卵巢肿瘤抑制剂BRCA一号突变是这种方法的第一个临床实例。最近,POLQ被发现在常见肿瘤中具有合成致死性BRCA和异步传输模式突变,为PARPi耐药肿瘤提供了一种替代治疗策略。

DNA损伤反应分析

DNA损伤反应分析在研究DNA损伤反应蛋白和开发具有巨大疾病治疗潜力的途径小分子调节剂方面发挥着至关重要的作用。在贝尔布鲁克,我们开发并商业化了现成的DDR蛋白检测方法,这将加快研究人员发现这些调节剂的努力。  我们专注于为难以获得酶或开发检测方法的更难对付的酶目标创建完整的检测解决方案,以便您可以专注于优化先导分子。我们还为那些不想在内部进行分析的人提供线索发现和分析开发服务。通过我们的服务,您将直接与我们的科学家合作,他们是DDR途径的专家。我们的服务提供快速的周转时间、定制的检测条件和丰富的专业知识。

彗星检测、彗星分析步骤——Cell Biolabs的Comet Assay

DNA损伤-由于环境因素或者细胞内正常的代谢会导致每天每个细胞内1000-1000000个分子发生损伤。当然,这不过是人类基因组中60亿正常基因的微不足道的组成部分。但是,如果损伤是发生在很关键的基因上面的时候,那么就有可能造成所在细胞不能正常的执行生理功能,严重的话,有可能会诱发癌症的发生。

彗星检测或者称为单细胞凝胶电泳试验- single cell gel electrophoresis assay(SCGE)是一种用来检测单细胞内DNA损伤情况的检验技术。在电泳试验中,受损的蜂窝状的DNA(包含有断裂的片段和碎片)会和未受损的DNA分子区分开来。一种类似于“彗星尾巴”的现象就会出现在显微镜下。DNA受损范围可以通过观察彗尾来进行评估,当然,我们也可以通过相关的分析软件来进行评估。

1988年Singh等科学家建立了碱性彗星实验用以对DNA对损伤程度做出评估,之后又有实验人员对Singh等建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯(可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet,UV),属于UVC波段范围)作为DNA损伤的诱导因子,诱导K562细胞DNA损伤,用改良彗星实验检测损伤程度。

Cell Biolab公司的OxiSelect™ Comet Assay是一种通过彗星分析快速灵敏检测DNA损伤的试剂盒系统。首先我们将细胞与融化的琼脂充分混合后涂抹到试剂盒中的OxiSelect™ Comet Slide上面,之后这种植入的细胞要用裂解缓冲液和碱性溶液进行处理,这样会使DNA松弛与产生变性。最后,通过水平电泳将完好的DNA与有损伤的DNA分开,之后将样本用DNA染料进行染色,然后在倒置荧光显微镜下观察。在显微镜下我们观察彗星检测、彗星分析步骤——Cell Biolabs的Comet Assay到受损的DNA是有彗尾产生的。如下图所示Cell Biolabs公司彗星检测操作的一个典型图示过程:

【试验准备】

试剂盒内提供彗星分析用的Slide盖片、OxiSelect™彗星琼脂凝胶、Vista DNA绿色染料、裂解缓冲液等,首先按照Protocal配制其他常规试剂并做预处理。

如需要将OxiSelect™彗星琼脂凝胶装入瓶中,在90-95ºC的条件下水浴20分钟到琼脂凝胶呈液态,然后将琼脂凝胶放到37度的水浴锅中备用。而Vista DNA绿色染料则需要用提供的TE缓冲液稀释为1X的溶液,储存在4度条件下备用,可储存3周,需要避光保存。

另外对于电泳液的选择,需要根据试验的需要和灵敏度来选择合适的电泳液,TBE适合用于检测细胞的凋亡和彗尾的长度分析,TBE电泳能够检测单链和双链DNA的破裂,有时候也能检测到AP的位置。而碱性电泳液能提高检测灵敏度,不但微小的DNA破裂能检测到,甚至大多数的AP位置和碱性的不稳定DNA加合物也能检测出来。具体的选择和配置详见Protocal。

【试验步骤】

1.在实验前将裂解缓冲液,碱性溶液和电泳液准备好,4度存储。

2.将OxiSelect™ Comet琼脂水浴加热到90-95ºC 20分钟或者直到琼脂糖变成液态,然后将琼脂糖放到37度的水浴锅中备用。

3.准备细胞样本,包括对照样本

a)悬浮细胞:将细胞悬浮于离心管中700g离心2分钟后弃去上清,用冷冻的PBS (无Mg2+、Ca2+)冲洗一次,离心,去上清。最后用冷冻的PBS (无Mg2+、Ca2+)将细胞悬浮为1 x 105 cells/mL。

b)贴壁细胞:将细胞取出,用橡胶刮片转移到一个锥形瓶中700g离心2分钟后弃去上清,用冷冻的PBS (无Mg2+、Ca2+)冲洗一次,离心,去上清。最后用用冷冻的PBS (无Mg2+、Ca2+)将细胞悬浮为1 x 105 cells/mL。

c)组织样本:将组织切开,将一小块组织放到1-2ml含有20 mM EDTA的冰的PBS(无Mg2+、Ca2+)中,浸泡5分钟,将上清转移到离心管中,离心,去上清。最后用用冷冻的PBS (无Mg2+、Ca2+)将细胞悬浮为1 x 105 cells/mL。

4.将细胞样本与琼脂糖以1:10的比例混合,然后立刻用吸管按75ul/孔的量铺到OxiSelect™ Comet Slide玻璃板中,必须保证每孔都铺均匀了。(注意:如果样本量比较大的时候,我们要在37度的条件下加样,以免琼脂糖凝结。)

5.保持玻璃板的水平,将板子转移到4度避光条件下静止15分钟;

6.将玻璃板转移到一个盛有裂解缓冲液 (~25mL/slide)的容器中,在4度避光中静止30-60分钟;

7.轻轻吸去裂解缓冲液,加入预先准备好的碱性溶液(~25 mL/slide). 在4度黑暗中静止30分钟;

8.电泳

【试验结果】

彗星检测、彗星分析步骤——Cell Biolabs的Comet Assay

图为:Etoposide Treatment of Jurkat Cells,左边的图是没处理过的细胞,右边的是处理过的细胞,碱性电泳条件为33 V/300 mA 15分钟。由上图可见明显的彗尾,也就是DNA损伤状态。

【结果分析】(定量化分析非必须)

您也将试验图片进行定量化分析。DNA损伤的结果衡量是用衡量“慧头”与“彗尾”的位置来进行的,尾部瞬间与尾部的DNA百分比含量是用来分析结果的重要参数,样本中至少应该分析50-100个细胞,在样本中,尾部瞬间图应该在DNA损伤的图中被标注出来,这样DNA的损伤可以与DNA的遗传物质迁移进行对比,然后来计算结果。彗星检测、彗星分析步骤——Cell Biolabs的Comet Assay

彗尾DNA的含量%=彗尾DNA的光密度/细胞DNA的光密度

彗尾位移可以用以下方法来进行测量:
a) Olive彗尾位移=彗尾的DNA% X 彗尾的位移长度
b) 彗尾的位移面积=彗尾的DNA% X 彗尾长度

现在在也开发了好多彗星试验分析的商业软件。例如LACAAS 来自于Loats Associates, Inc.) 和Comet Assay IV 来自于Perceptive Instruments。

Cell Biolabs的OxiSelect™ Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)试剂盒提供多种样式供您选择,有3孔板(货号:STA-350/351/351-5)和96孔板(货号:STA-355/355-5)不同样式。其中OxiSelect™ Comet Assay Kit中,包含彗星分析载玻片、彗星分析用琼脂糖以及其它试剂;另外Cell Biolabs根绝您的实验要求,还单独提供彗星分析载玻片,也根据3孔板样式和96孔板样式分为多种样式(货号:STA-352/353/353-5/SAT-356/STA-356-5)。每种彗星分析样式均有多种包装供您选择。另外,还提供单独的彗星分析阳性和阴性细胞作为您的试验对照(货号:STA-354)。如果您对以上产品感兴趣,请请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询氧化应激及损伤相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

DNA双链断裂(DSBs)分析及检测——DNA/RNA损伤分析系列

DNA作为细胞生命活动最重要的遗传物质,保持其分子结构的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常生理功能的发挥具有重要意义。包括电离辐射、化疗药物及细胞代谢产物在内的多种外源和内源性因素都能引起不同形式的DNA损伤,其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为最严重的DNA损伤形式,使细胞正常生命活动的维持乃至生存都受到了严重威胁。同时,细胞也建立了一套复杂而精确的调控机制来应对这些损伤,包括激活细胞周期检查点(checkpoint)、启动修复系统及诱导细胞凋亡等。

针对DNA/RNA损伤的检测,上海金畔生物科技有限公司向您推荐Cell BioLabs完整的DNA/RNA氧化损伤检测方案,其OxiSelect™ Oxidative DNA / RNA Damage ELISA Kits(8-OHdG or 8-OHG Quantitation)提供了快速高效检测核酸中8-OHG或8-OHdG含量的实验方案;OxiSelect™ Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)则为您提供多种选择的彗星分析产品;针对DNA损伤中的AP位点检测,Cell Biolabs的OxiSelect™ Oxidative DNA Damage Quantitation Kit (AP Sites)则使用经典的ARP检测方案;DNA双链断裂分析为您提供了快捷的DSB分析试剂。

细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂 (DSBs),以及细胞自身调控的DNA双链断裂(DSBs)分析及检测——DNA/RNA损伤分析系列程序性DSBs和逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs均可诱导H2AX的磷酸化和簇集。DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX的C末端第139位丝氨酸残基被快速磷酸化形成γ-H2AX。磷酸化的γ-H2AX快速转导DNA损伤信号,导致下游分子磷酸化的激活,引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。γ-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子,也成为目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一。

Cell Biolabs的OxiSelect™ DNA Double Strand Break Assay(DNA双链断裂分析试剂盒)(货号:STA-321)采用免疫学方法,使用DNA双链断裂的标志物γ-H2AX抗体检测DNA损伤后其表达情况。试剂盒内提供Anti-Phospho-Histone H2A.X (Ser 139) Antibody (100X)一抗以相应二抗,并有DSB诱导物作为试验阳性对照,实验简单快捷,只需3小时,就能通过荧光显色观察结果。能为96孔板样提供100次分析。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
OxiSelect™ DNA Double-Strand Break Staining Kit STA-321 免疫荧光法检测,100次分析

上海金畔生物科技有限公司向您推荐Cell BioLabs完整的DNA/RNA损伤检测方案,其产品覆盖上述最重要的DNA/RNA损伤分析产品,为您提供最优的检测方案。除了常见的AP位点分析以及8-OHdG/8-OHG定量分析,还有基于单细胞水平的彗星分析和DNA双链断裂分析等。除了DNA/RNA损伤,还包括脂质过氧化过程中壬烯(HNE)、丙二醛(MDA)以及8-异前列腺素F2a(8-Isoprostane)ELISA分析检测试剂盒;对于蛋白质的羰基化、硝基化以及终末氧化蛋白产物分析等蛋白氧化损伤检测方案;针对活性氧基团和抗氧化剂的活力检测,也由多种试剂和试剂盒供您选择。如果您对以上产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询氧化应激及损伤相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

8-羟基-(脱氧)鸟嘌呤定量ELISA分析——DNA/RNA损伤分析

活性氧(ROS)自由基可以直接攻击生物大分子DNA/RNA诱发DNA/RNA氧化损伤。DNA分子的损伤类型有多种。UV照射后DNA分子上的两个相邻的胸腺嘧啶 (T)或胞嘧啶(C)之间可以共价键连结形成环丁酰环,这种环式结构称为二聚体。DNA 分子还可以发生个别碱基或核苷酸的变化。例如碱基结构类似物5-溴尿嘧啶等可以取代个别碱基等。

针对DNA/RNA损伤的检测,上海金畔生物科技有限公司向您推荐Cell BioLabs完整的DNA/RNA氧化损伤检测方案,其OxiSelect™ Oxidative DNA / RNA Damage ELISA Kits(8-OHdG or 8-OHG Quantitation)提供了快速高效检测核酸中8-OHG或8-OHdG含量的实验方案;OxiSelect™ Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)则为您提供多种选择的彗星分析产品;针对DNA损伤中的AP位点检测,Cell Biolabs的OxiSelect™ Oxidative DNA Damage Quantitation Kit (AP Sites)则使用经典的ARP检测方案;DNA双链断裂分析为您提供了快捷的DSB分析试剂。

在各种氧化损伤中,以鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羟基-[脱氧]鸟嘌呤(8-OHdG/8-OHG)最为常见。还有一些嘌呤或者嘧啶碱基直接脱去的反应,这样也就形成了核酸中无嘌呤(apurinic)和脱嘧啶(apyrimidinic)位点,统简称AP位点。除了上述氧化损伤外,DNA双链断裂(DSBs)是细胞内多种类型的DNA损伤中最危险、最8-羟基-(脱氧)鸟嘌呤定量ELISA分析——DNA/RNA损伤分析严重的一种。上海金畔生物科技有限公司向您推荐Cell BioLabs完整的DNA/RNA损伤检测方案,其产品覆盖上述最重要的DNA/RNA损伤分析产品,为您提供最优的检测方案。

其中OxiSelect™ Oxidative DNA / RNA Damage ELISA Kits(8-OHdG or 8-OHG Quantitation)提供了快速高效检测核酸中8-OHG或8-OHdG含量的实验方案。在各种氧化损伤中,以鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羟基-脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)最为常见8-羟基-脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)因此也成为DNA损伤最普遍的标志物。作为DNA损伤的副产物,当有化学致癌物刺激时,会产生更多的8-OHdG。在生物体内核酸外切酶修复损伤DNA时,形成的8-羟基-脱氧鸟嘌呤会被分泌出去而不会进行尿液中进行进一步的代谢。同样的情况也在RNA中发生,只不过是由鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羟基-鸟嘌呤(8-OHG),其也被作为RNA损伤的重要检测指标。

Cell Biolabs的OxiSelect™ Oxidative DNA / RNA Damage ELISA Kits试剂盒采用竞争性ELISA方法定量8-OHdG/8-OHG。待测样品和8-OHdG/8-OHG标准样分别加入8-OHdG/8-OHG-BSA联结的EIA板内,孵育一段时间后,加入anti-8-OHdG/anti-8-OHG单抗,然后加入HRP联结的二抗,通过与8-OHdG/8-OHG标准曲线比对获得最终数据。该试剂盒检测灵敏,能有效检测样品中100pg/ml的8-OHdG或300pg/ml的8-OHG含量,每个试剂盒能完成至少96次分析。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
OxiSelect™ Oxidative DNA Damage ELISA Kit (8-OHdG Quantitation) STA-320 ELISA比色法检测,96次分析
STA-320-5 ELISA比色法检测,5×96次分析
OxiSelect™ Oxidative RNA Damage ELISA Kit (8-OHG Quantitation) STA-325 ELISA比色法检测,96次分析
STA-325-5 ELISA比色法检测,5×96次分析

上海金畔生物科技有限公司向您推荐Cell BioLabs完整的DNA/RNA损伤检测方案,其产品覆盖上述最重要的DNA/RNA损伤分析产品,为您提供最优的检测方案。除了传统的8-OHdG/8-OHG定量、AP位点分析等,还有基于单细胞水平的彗星分析和DNA双链断裂分析。除了DNA/RNA损伤,还包括脂质过氧化过程中壬烯(HNE)、丙二醛(MDA)以及8-异前列腺素F2a(8-Isoprostane)ELISA分析检测试剂盒;对于蛋白质的羰基化、硝基化以及终末氧化蛋白产物分析等蛋白氧化损伤检测方案;针对活性氧基团和抗氧化剂的活力检测,也由多种试剂和试剂盒供您选择。如果您对以上产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询氧化应激及损伤相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

Cell Biolabs彗星实验试剂盒

由于环境因素和细胞内的正常代谢过程造成的DNA损伤,每个细胞每天都会发生1,000到1,000,000个。虽然这些只占人类基因组约60亿个碱基中的一小部分,但如果关键基因损伤未及时修复,可能会阻碍细胞的正常生理功能,进而增加癌变可能。彗星实验,或称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一种测量单个细胞DNA损伤的常用技术。其原理很简单,即在电泳场中,将受损细胞DNA(包含片段和链断裂)与完整的DNA分离,通过显微镜可观察到损伤细胞呈现出典型的彗星状尾巴,然后通过测量计算彗尾大小对比出细胞DNA损伤的程度。因为彗星实验的特点,该方法几乎被用来评估任何类型的真核细胞的 DNA 修复能力,包括双、单链断裂的不同的 DNA 损伤情况。是一种能快速、大通量检测真核细胞DNA损伤进而判别遗传毒性的技术。

Cell Biolabs彗星实验试剂盒

彗星实验结果图

彗星实验原理虽简单,但操作繁琐,需要丰富的实验经验和技巧,尤其常常出现的“脱胶”问题,困扰了许多科研人员。除此之外,有时为了跑出完美的“彗星”图案放在paper里,还需要重复做许多次实验,费时费力。为了解决上述问题,我们推荐CellBiolabs的OxiSelectTMComet Assay Kit即彗星实验试剂盒来检测细胞的DNA损伤。该试剂盒不仅能让彗星实验化繁为简,还有两种不同规格(3孔和96孔)的细胞电泳凝胶板供选择,让少量样本和大量样本的DNA损伤检测通通轻松hold住。用该试剂盒做彗星实验流程如下图。

Cell Biolabs彗星实验试剂盒

除了操作简便,OxiSelectTMComet Assay Kit还有以下优点:

1)      适用于各种DNA损伤检测,是一款非常好用的DNA损伤检测筛选工具;

2)      试剂盒中的载玻片经过特殊处理以粘附低熔点琼脂糖,避免“脱胶”问题出现;

3)      采用特殊的DNA荧光染料,能有效降低背景干扰,更加方便读取实验结果。


彗星实验试剂盒信息:

品名

货号

规格

说明

OxiSelectTM Comet Assay Kit (3-Well Slides)

STA-350

15 assays

试剂盒内有5张3孔载玻片和彗星实验所需的低熔点琼脂糖、裂解液及DNA荧光染料等,共可检测15个样品。

OxiSelectTM Comet Assay Kit (3-Well Slides)

STA-351

75 assays

试剂盒内有25张3孔载玻片和彗星实验所需的低熔点琼脂糖、裂解液及DNA荧光染料等,共可检测75个样品。

OxiSelectTM Comet Assay Kit (96-Well Slides)

STA-355

96 assays

试剂盒内有1张96孔载玻片和彗星实验所需的低熔点琼脂糖、裂解液及DNA荧光染料等,共可检测96个样品。

为了满足客户更多样的实验需求,彗星实验试剂盒内特殊处理电泳载玻片还可以单独购买,详情如下:

品名

货号

规格

产品图片

Comet Assay Slides, 3-Well

STA-352

5 slides

Cell Biolabs彗星实验试剂盒

STA-353

25 slides

Comet Assay Slides, 96-Well

STA-356

1 slides

Cell Biolabs彗星实验试剂盒

STA-356-5

5 slides

产品部分发表文献:

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