3） 实验中若需固定细胞，比如凋亡检测同时还需要检测细胞周期，请不要选用Annexin V-EGFP，可使用Annexin V-FITC，因为固定过程中EGFP会变性导致无荧光。

4） 若样品来源于血液，务必先去除血液中的血小板。因为血小板含有PS，会与Annexin V结合产生假阳性。可使用含EDTA的缓冲液并低速离心去除血小板。

5） 荧光物质易发生淬灭，试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。

6） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步骤

1.1 细胞样品的准备：

a）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b）对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

1.2 用去离子水按照1:3稀释结合缓冲液到1×，比如，5ml结合缓冲液（4×）加入15ml去离子水。

1.3 用结合缓冲液（1×）重新悬浮细胞并调整浓度为1-5×106/ml。

1.4 取100µl的细胞悬液到5ml流式管中，加入5µl Annexin V-EGFP混匀，室温避光孵育5min。

1.5 再加入10µl碘化丙啶溶液，并加400µl结合缓冲液（1×），混匀，尽快（＜1h）用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。

【注意】：方便起见，步骤1.4内可同时加入5µl Annexin V-EGFP和10µl碘化丙啶溶液混匀，室温避光孵育5min。然后加入400µl结合缓冲液（1×）混匀，但需尽快（＜1h）用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。但为了减少实验误差，建议按照1.4-1.5的步骤来操作。因PI受时间影响比较大，细胞标记上PI后毒性会增加。随着时间延长会导致PI染色增加，尤其是检测早期凋亡时，误差会明显加大。建议PI加入后立即开始检测。

二、 染色检测

2.1流式细胞仪分析

1）请根据以下设计实验：

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V-EGFP和碘化丙啶溶液。目的用来调节电压。

单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V-EGFP。目的用来调节补偿。

检测管：处理细胞组，加Annexin V-EGFP和碘化丙啶溶液。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需的流式数据。

2）对于Annexin V-EGFP（Ex=488nm，Em=530nm），用流式细胞仪的FITC信号检测器（通常F1通道）；对于PI-DNA复合物（Ex=535nm，Em=615nm），用流式细胞仪的PE发射信号检测器（通常F2通道）。

3）用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），EGFP为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型实验结果中，细胞可分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，凋亡早期细胞仅有较强的绿色荧光，凋亡晚期细胞或坏死细胞有绿色和红色的双重荧光染色。

2.2荧光显微镜分析

1)滴一滴用Annexin V-EGFP/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。【注意】：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。探针孵育结束后，可将盖玻片倒置在载玻片上并进行观察。需要在染色结束后尽快（＜1h）进行观察。

2)于荧光显微镜下用双色滤光片（FITC/罗丹明）进行观察。早期凋亡细胞，仅结合Annexin V-EGFP的细胞质膜呈现绿色荧光。而丧失膜完整的细胞在细胞核上被PI染色呈现红光，且在细胞表面（质膜）上因被Annexin V-EGFP染色呈绿色光环。

常见问题

1） Annexin V/PI凋亡试剂盒能够用于检测人或其他动物的细胞凋亡情况？

回复：可以，因Annexin V特异性结合PS，而PS在不同种属间无差异。

2）贴壁细胞做凋亡用胰酶消化对细胞膜有损伤？

回复：低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，4℃，1000rpm离心5min， 处理得当的话， 胰酶造成损伤可以控制在 5%以内，在有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

3）贴壁细胞可先染PI然后再消化吗？这样是否可减少由于消化液造成的细胞膜损伤而染上PI的误差？

回复：先加 PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断， 而且PI本身对细胞也是有毒性的， 对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。

4）为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响？

回复：因Annexin V是钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，EDTA是一种金属螯合剂。因此EDTA的加入会影响Annexin V活性，进而影响结果。

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3） 实验中若需固定细胞，比如凋亡检测同时还需要检测细胞周期，请不要选用Annexin V-EGFP，可使用Annexin V-FITC，因为固定过程中EGFP会变性导致无荧光。

4） 若样品来源于血液，务必先去除血液中的血小板。因为血小板含有PS，会与Annexin V结合产生假阳性。可使用含EDTA的缓冲液并低速离心去除血小板。

5） 荧光物质易发生淬灭，试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。

6） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步骤

1.1 细胞样品的准备：

a）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b）对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

1.2 用去离子水按照1:3稀释结合缓冲液到1×，比如，5ml结合缓冲液（4×）加入15ml去离子水。

1.3 用结合缓冲液（1×）重新悬浮细胞并调整浓度为1-5×106/ml。

1.4 取100µl的细胞悬液到5ml流式管中，加入5µl Annexin V-EGFP混匀，室温避光孵育5min。

1.5 再加入10µl碘化丙啶溶液，并加400µl结合缓冲液（1×），混匀，尽快（＜1h）用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。

【注意】：方便起见，步骤1.4内可同时加入5µl Annexin V-EGFP和10µl碘化丙啶溶液混匀，室温避光孵育5min。然后加入400µl结合缓冲液（1×）混匀，但需尽快（＜1h）用流式细胞仪或荧光显微镜完成检测。但为了减少实验误差，建议按照1.4-1.5的步骤来操作。因PI受时间影响比较大，细胞标记上PI后毒性会增加。随着时间延长会导致PI染色增加，尤其是检测早期凋亡时，误差会明显加大。建议PI加入后立即开始检测。

二、 染色检测

2.1流式细胞仪分析

1）请根据以下设计实验：

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V-EGFP和碘化丙啶溶液。目的用来调节电压。

单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V-EGFP。目的用来调节补偿。

检测管：处理细胞组，加Annexin V-EGFP和碘化丙啶溶液。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需的流式数据。

2）对于Annexin V-EGFP（Ex=488nm，Em=530nm），用流式细胞仪的FITC信号检测器（通常F1通道）；对于PI-DNA复合物（Ex=535nm，Em=615nm），用流式细胞仪的PE发射信号检测器（通常F2通道）。

3）用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），EGFP为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型实验结果中，细胞可分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，凋亡早期细胞仅有较强的绿色荧光，凋亡晚期细胞或坏死细胞有绿色和红色的双重荧光染色。

2.2荧光显微镜分析

1)滴一滴用Annexin V-EGFP/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。【注意】：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。探针孵育结束后，可将盖玻片倒置在载玻片上并进行观察。需要在染色结束后尽快（＜1h）进行观察。

2)于荧光显微镜下用双色滤光片（FITC/罗丹明）进行观察。早期凋亡细胞，仅结合Annexin V-EGFP的细胞质膜呈现绿色荧光。而丧失膜完整的细胞在细胞核上被PI染色呈现红光，且在细胞表面（质膜）上因被Annexin V-EGFP染色呈绿色光环。

常见问题

1） Annexin V/PI凋亡试剂盒能够用于检测人或其他动物的细胞凋亡情况？

回复：可以，因Annexin V特异性结合PS，而PS在不同种属间无差异。

2）贴壁细胞做凋亡用胰酶消化对细胞膜有损伤？

回复：低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，4℃，1000rpm离心5min， 处理得当的话， 胰酶造成损伤可以控制在 5%以内，在有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

3）贴壁细胞可先染PI然后再消化吗？这样是否可减少由于消化液造成的细胞膜损伤而染上PI的误差？

回复：先加 PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断， 而且PI本身对细胞也是有毒性的， 对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。

4）为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响？

回复：因Annexin V是钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，EDTA是一种金属螯合剂。因此EDTA的加入会影响Annexin V活性，进而影响结果。

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Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit

细胞凋亡检测试剂盒

产品信息

产品描述

Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit）是一款用来检测细胞凋亡的试剂盒，可以用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。本试剂盒包含融合增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的Annexin V，用来检测早期细胞凋亡；以及碘化丙啶（PI），用来检测坏死细胞。

本试剂盒的工作原理在于：磷脂酰丝氨酸（Phosphotidylserine，PS）是一种带负电荷的磷脂。正常细胞中，PS位于细胞膜内面，但当凋亡开始后，PS在磷脂双分子层中的不对称分布逐渐消失并转移到细胞膜表面，从而暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V（Annexin V）是一种分子量约35kDa的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能非常容易的结合PS，且具有高度的亲和性。因此，通过Annexin V与PS的结合与否来判断凋亡发生。另外，PI的引入能辅助区分凋亡早期细胞和晚期凋亡或坏死细胞。PI作为一种活细胞排斥探针，不能穿透具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡早期细胞，但能穿透丧失细胞膜完整性的凋亡晚期细胞或坏死细胞，从而将细胞核染红。因此，将Annexin V-EGFP与PI联合使用时，呈现结果为：正常细胞（Annexin V-EGFP-/PI-），早期凋亡细胞（Annexin V-EGFP+/PI-）；晚期凋亡细胞和坏死细胞同时呈现双阳性（Annexin V-EGFP+/PI+）。

产品组成

保存与运输方法

保存：2-8℃保存，不可冰冻。其中组分A，B需避光保存。1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 由于细胞凋亡是一个快速过程，染色后请尽快检测，时间过长会导致凋亡或坏死细胞数量增加。

2） 对于贴壁细胞，需要很好掌控消化步骤。细胞凋亡诱导时贴壁细胞如有漂浮细胞，需同时收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色。处理贴壁细胞时要小心，尽量避免人为造成的细胞损伤。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，导致PI摄入过多；而胰酶消化时间过长，细胞膜也易造成损伤，甚至会影响细胞膜PS与Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，之后倒掉大部分胰酶，利用残留的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。