多聚(A)聚合酶详细说明
多聚(A)聚合酶
用于制作 PolyA 加尾 RNA 和 3' 末端 RNA 标记
1000 U 的 Poly(A) 聚合酶 (5000 U/mL) 和 10x Poly(A) 聚合酶反应缓冲液。
Poly(A) 聚合酶适用于分子生物学应用。该产品既不用于疾病的诊断、预防或治疗，也未经过验证可单独使用或与其他产品结合使用。
特征
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催化 ATP 中的 AMP 添加到 RNA 的 3' 羟基上
产品详情
Poly(A) 聚合酶将 ATP（由 AMP 催化）附着到 RNA 的 3ʹ 羟基上，这对于制备带有 Poly(A) 尾的 RNA 非常有用。
该酶以 25 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、1 mM MgCl 2、0.1 mM DTT、0.1 mM EDTA 和 50% 甘油的形式提供；25°C 时 pH 8.0。
10 倍浓度的 Poly(A) 聚合酶反应缓冲液包含 500 mM Tris-HCl、2.5 M NaCl 和 100 mM MgCl 2，25°C 时 pH 为 7.9。
表现
Poly(A) 聚合酶催化 ATP 中的 AMP 添加到 RNA 的 3ʹ 羟基上。该反应需要 Mg 2+并且与模板无关。
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存储温度：–25°C 至 –15°C
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分子量：53,870 道尔顿
| 测试 | 测试单位 | 规格 |
|---|---|---|
| 纯度 | >95% | |
| 具体活性 | >20,000 U/毫克 | |
| 单链核酸外切酶 | 200U | <5% 释放 |
| 双链核酸外切酶 | 200U | 释放<1% |
| 双链核酸内切酶 | 200U | 无转换 |
| 大肠杆菌DNA 污染 | 100U | <10份 |
| 核糖核酸酶污染 | 200U | 未检测到非特异性 RNase |
原则
该蛋白质由表达质粒 Poly(A) 聚合酶基因的 大肠杆菌菌株产生。
1 个单位定义为在 37°C 下 10 分钟内将 1 nmol ATP 结合到酸不溶性物质中的酶量。
程序
使用说明
1. 按所列顺序配制总体积为 20 µL 的以下反应混合物：
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15 µL 无核酸酶水中的 1-10 µg 纯化 RNA
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2 µL 10x Poly(A) 聚合酶反应缓冲液 (B7460)
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2 µL 10mM ATP (N2070-10)
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1 µL Poly(A) 聚合酶 (P7460L)
2. 将反应混合物在 37°C 下孵育 30 分钟。
3. 通过添加 EDTA（终浓度 10mM）终止反应或继续进行净化步骤。
质量控制
使用两倍系列稀释法测量比活性。在 1x 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、10 mM MgCl 2、pH 7.9、25°C 下）中稀释酶，并添加到含有 15-mer RNA 寡核苷酸、1x 反应缓冲液的 50 µL 反应液中、1 mM ATP、2.5 mM MnCl 2和 3H-ATP。反应在 37°C 下孵育 10 分钟，置于冰上，并使用 Sambrook 和 Russell 的方法进行分析（分子克隆，v3，2001，第 A8 页）。 25-A8.26）。
蛋白质浓度由 OD 280吸光度确定。
通过浓缩和稀释酶溶液的 SDS-PAGE，然后进行银染检测来评估物理纯度。通过将浓缩样品中污染物条带的总质量与稀释样品中目标蛋白质对应的条带质量进行比较来评估纯度。
单链核酸外切酶在 50 µL 反应液中测定，其中含有放射性标记的单链 DNA 底物和 10 µL 酶溶液，并在 37°C 下孵育 4 小时。
双链核酸外切酶活性在 50 µL 反应液中测定，其中含有放射性标记的双链 DNA 底物和 10 µL 酶溶液，并在 37°C 下孵育 4 小时。
双链核酸内切酶活性在含有 0.5 µg 质粒 DNA 和 10 µL 酶溶液的 50 µL 反应液中测定，并在 37°C 下孵育 4 小时。
使用 5 µL 酶溶液重复样品评估大肠杆菌污染，这些样品已变性，并使用与 16S rRNA 基因座相对应的寡核苷酸引物 在 TaqMan qPCR 测定中筛选污染大肠杆菌基因组 DNA 的存在 。
使用 RNAse Alert 试剂盒（Integrated DNA Technologies）按照制造商的指南评估非特异性 RNAse 污染。
应用领域
该产品可用于分子生物学应用，例如：
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制备多聚A尾RNA
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3'端RNA标记
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mRNA疗法