内毒素污染对基因治疗和细胞治疗的影响

应用于基因治疗的载体多种多样，可分为病毒型和非病毒型。病毒载体是目前美国食品和药物管理局（FDA）批准的基因疗法中使用的载体，而非病毒技术作为一种安全有效地将遗传物质运送给细胞以达到治疗效果的方法正在研究当中¹。但与非病毒载体相比，病毒载体的基因转移效率高10倍至1000倍。然而我们应该意识到，基于非病毒载体的基因疗法安全水平高且生产成本低，具有非常高的吸引力，在未来的药物开发中具有很大的潜力⁵。

目前最常见的两种载体是质粒和病毒。质粒是细胞内的一种小型染色体外DNA分子，与染色体DNA物理分离，可以独立复制。最常以小型环状双链DNA分子的形式出现在细菌中，但有时也会出现在古细菌和真核生物中。在自然界中发现的质粒，往往携带着有利于生物体生存的基因，并能提供独特的优势，例如对抗生素的强烈抗性。染色体很大，并且含有在“正常条件“下生活的全部基本遗传信息，而质粒通常很小，只含有在某些压力、逆境或疾病状态下才可能发挥作用的额外基因²。另一方面，由病毒载体包装的基因可以整合到宿主细胞的基因组中并永久表达。一些类型的病毒可将其基因组插入宿主的细胞质中，但实际上并没有进入细胞，而另一些病毒会伪装成可穿透细胞膜的蛋白分子，进而很容易地进入细胞。可能发生的病毒性感染主要有两种类型，一种被称为裂解性感染，另一种为溶源性感染。裂解循环的病毒在插入其DNA后不久就迅速产生更多的病毒，随后从细胞中迸发出来，继续感染越来越多的细胞。溶源性病毒则是将其DNA整合至宿主细胞的DNA后，在对某个触发因素作出反应前可在体内存活多年。病毒会像细胞一样繁殖，并且不会对所依赖的宿主造成任何伤害，直至被某种方式触发。一旦被触发，病毒就会从宿主的DNA中释放出来，以此创造新的病毒³。

最早应用于基因治疗的病毒载体是以腺病毒为基础的，腺病毒会引起普通感冒以及人类呼吸道、肠道和眼部感染¹。腺病毒以双链DNA的形式携带遗传物质。当进入宿主细胞时，这种遗传物质可短暂存在于细胞核中，因此能够像其他基因一样自由进行转录。并且，人们发现腺病毒会在患者体内引发强烈的、具有潜在危险的免疫反应，因此，使用该类型病毒进行基因治疗的研究仍在继续³。逆转录病毒、单纯疱疹病毒等其他病毒载体也已被使用。

基因治疗产品与所有人体治疗药物一样，关键在于不受内毒素污染。内毒素，也被称为脂多糖（lipopolysaccharide）或LPS，是革兰氏阴性细菌外细胞膜的一种成分。作为一种极强的热原，微量接触也会导致危险的发烧甚至败血症。此外，内毒素具有高度的耐热性，很难通过传统的方法来清除。

根据FDA管理指南，所有静脉注射药品的内毒素含量必须低于5 EU每公斤体重。但内毒素普遍存在于环境，实验室也不例外，因此，基因治疗产品在用于人体测试前进行内毒素污染测试是至关重要的。

2019年发表于《Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 》的一篇论文测试了一种从重组腺相关病毒（rAAV，一种常见的基因治疗载体）原液中去除内毒素污染的新方法。大肠杆菌通常是内毒素污染的来源，rAAV便是由大肠杆菌中分离出来的质粒DNA制备而来。⁸

该作者使用LAL（美洲鲎试剂）检测法来定量内毒素水平。清除rAAV原液的挑战之一是任何残留的洗涤剂都会引起毒性，还会干扰LAL检测试剂，从而导致假阴性。其原因在于掩蔽效应，即脂多糖分子被洗涤剂分子包围，无法与LAL试剂相互作用。因此，作者将洗净原液中的洗涤剂水平保持在临界值以下，以便于使用LAL精准地检测内毒素。⁸

这项研究强调了彻底净化基因治疗产品的重要性，以及为了去除残留的洗涤剂而进行严格的交换缓冲液冲洗的必要性。随着基因治疗的普及，科学家们仍须意识到内毒素污染潜在危险的重要性，以及需要避免由于洗涤剂残留而造成假阴性结果。⁸

与基于基因疗法的治疗方法一样，细胞治疗产品也需要考虑可能受到污染的问题。细胞治疗产品包括细胞免疫疗法、癌症疫苗和应用于某些治疗适应症的其他类型自体或异体细胞，如造血干细胞和成人及胚胎干细胞。基因治疗是通过蛋白载体或载体将遗传物质转移到合适的细胞中，而细胞治疗是将具有相关和必要功能的细胞转移到患者体内。^4,6

 在实验室环境中培养任何一种类型的细胞时，所面临的首要问题始终是避免污染。生物污染往往是工作的重点，同时也是最容易检测和避免的。

例如，大多数细菌或真菌污染在细胞培养基中肉眼可见，并可以使用抗生素处理来预防。而支原体或其他细胞系等其他生物污染物则更难检出，但仍可通过市面上的检测试剂盒进行检测。

 化学污染与生物污染相比，受到的关注相对较少，并且更难检测和避免。其中，最隐蔽的化学污染物就是内毒素。潜在的内毒素污染源包括水、细胞培养基、血清、玻璃制品和塑料制品。正如本文在基因治疗产品部分中所提及，细胞治疗中发现的内毒素对高压灭菌和辐照都有很强的耐受力，这意味着它们可以在没有活细菌的情况下存在。其高疏水性也使其对塑料制品具有很强的亲和力，而且内毒素与活细菌不同，在细胞培养基无法通过肉眼确认。此外，内毒素不能用抗生素去除，需要使用专门的内毒素清除溶液。

采取措施避免内毒素引起的细胞培养问题，可以使研究人员对实验结果更有信心。为了帮助保持细胞培养物及其产生的疗法不受内毒素的污染，人们已提出了多种解决方法。其中，包括使用高纯度的水和低内毒素的FBS，以及使用经认证为无内毒素的塑料器皿。⁷ 然而，除了使用纯化的原材料和试剂外，建立强大的无菌技术和灭菌程序，对减少内毒素污染的几率而言也非常重要。

无菌技术是每一位生物研究人员必备的核心技能之一。为避免出现实验伪像和潜在的细胞死亡，有必要防止细胞培养物的污染。此外，动物研究中的污染也可能导致感染或死亡。

大多数生物污染物可以使用漂白剂或乙醇等标准的消毒试剂来避免，但内毒素高度稳定，在没有活菌的情况下也能继续存在。因此，对于质控技术人员来说，保持严格的无菌技术标准操作程序至关重要。

定期更换手套是内毒素相关无菌技术的示例之一。没有经验的细胞培养技术员可能认为经常用乙醇喷洒手套就足以保持无菌状态，但乙醇可能会带来内毒素污染，因此，应为使用者制定更换手套的频率标准。

内毒素污染会极大地影响体外实验，特别是涉及免疫细胞的实验。巨噬细胞对内毒素的反应表现为IL-6分泌增加，而T细胞的表现为增殖和淋巴因子的产生增加。

受到内毒素的影响，非免疫细胞也可能会失调。传统上认为内毒素是通过CD14受体起作用的，但缺乏这种受体的细胞仍可对内毒素污染表现出强烈的反应。例如，一项研究报告指出，心肌细胞在暴露于内毒素时，会出现收缩功能障碍。其他研究也报告了CHO细胞内蛋白产生的改变以及输尿管上皮细胞中克隆效率的改变。

此外，不同的细胞系对内毒素污染的灵敏程度差异巨大。一些细胞系在内毒素低于1 ng/mL的情况下即表现失调，而其他细胞系则需要高达5000 ng/mL的浓度。也有理论认为，在培养中生长多年的细胞系（如HeLa和CHO细胞）可能随着时间的推移被自然选择为耐内毒素。基于这一点，很难确定一个广泛适用的内毒素污染安全阈值。

进行细胞培养时，购买低含量内毒素产品是至关重要的。然而，内毒素污染可能在打开试剂后产生，或在玻璃器皿/塑料器皿中转移污染，因此定期进行内毒素检测显得十分重要。

对于基因治疗和细胞治疗产品来说，鲎试剂（LAL）检测法为量化内毒素水平提供了一个兼具成本效益和高灵敏度的选择。本检测法依赖于从鲎血液中提取的蛋白，这些蛋白在内毒素存在的情况下发生凝结反应，可以对其定量以获取高度准确的内毒素水平读数。在维护我们的基因和细胞治疗的安全性方面，特别是应用于大规模生产以及重要的体外实验时，这种检测方法将会继续发挥关键作用。

◆相关产品

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◆参考文献

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隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

常磐生物株式会社

中西真人

◆前言

通过导入基因实现的细胞重编程始于MyoD基因的发现，该基因可以将小鼠成纤维细胞（构成真皮等结缔组织的细胞）转化为肌肉细胞^1）。然而，尽管许多研究人员辛勤耕耘，除了MyoD基因之外，并没有发现其他可以单独改变细胞特性的“主基因”。

2006年山中教授等人的研究表明，通过导入OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种基因，可以把组成外周组织的细胞重编程为人工诱导性多能干细胞（iPS细胞）^2）。这一发现有力地表明了需要组合多种因子来诱导细胞重编程，为再生医学领域带来了重大转机。目前还有多份研究报告了通过组合多种因子从而使体细胞不经由iPS细胞，直接转化为其他体细胞的直接重编程（Direct reprogramming），以及通过强制表达外源基因来诱导iPS细胞分化的定向分化（Directed differentiation）也都成为了可能。

若要将通过细胞重编程制备的细胞应用于再生医学，需使用高性能的基因导入/表达载体。若要均等地诱导重编程，必须将多个基因高效导入细胞，以一定比例稳定表达1~3周后将其从细胞中完全去除，但是能够满足这些要求的技术有限。本文将阐述目前被认为适用于细胞重编程技术的隐身型RNA载体的研发背景及应用现状。

◆使用RNA病毒的基因导入/表达载体

随着1973年磷酸钙转染法的发现，将基因导入动物细胞的方法开始作为一种实用方法逐步应用于研究领域。此后，在1980年代又开发出了至今仍被广泛使用的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体等重组病毒载体，以及使用正电荷脂质和DNA复合物的脂质转染法（Lipofection）等非病毒载体的基因转染法，由此提升了人们对基因治疗的期待。

另一方面，没有DNA复制中间体的RNA病毒通常具有很强的细胞毒性，因此被认为不适合作为基因导入载体（逆转录病毒和慢病毒虽然也属于RNA病毒，但与其他RNA病毒的不同之处在于其RNA通过逆转录产生的基因组cDNA会先被插入宿主的基因组DNA中再进行转录）。例如，以仙台病毒（RNA病毒的一种）为基础的载体，可以非常强烈地诱导基因表达，但由于其细胞毒性，它并不适合长期持续的表达。

笔者历经30多年，研发出一种无需将基因插入动物细胞基因组DNA即可实现持续性基因表达的RNA载体。仙台病毒中存在一种可在37°C下引起持续感染的突变株，称为Clone 151（cl.151）株^3,4）。笔者着眼于这种突变病毒，与分离出cl.151毒株的吉田哲也博士（现任广岛大学名誉教授）从1988年开始共同研究此毒株。当时，PCR法和DNA测序仪还没有普及，对具有约16 kb大基因组的仙台病毒变异株的研究寸步难行，于2007年报告分离了cl.151毒株全长基因组cDNA并分析了持续感染的机制^5），并于2011年成功研发出SeVdp（缺陷型和持久型仙台病毒，Defective and persistent Sendai virus）载体，该载体缺乏自主复制能力，同时可搭载4个外源基因并稳定表达^6）。

研究还发现，如果将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC基因全部搭载至SeVdp载体，可高效重编程细胞，由此成功确立了使用持续表达型RNA病毒载体进行细胞重编程的原理。此外，还导入了一种在iPS细胞中特异性表达的miR-302自动清除载体基因组RNA的机制^7），并在大量的实验室中应用于iPS细胞系的构建。

◆隐身型RNA载体的研发

通过对SeVdp载体的研究，揭示了使用RNA基因组实现稳定基因表达的必要条件。重要的是要避免干扰素诱导，在cl.151毒株中，编码RNA聚合酶的L基因突变会降低干扰素的诱导，与细胞毒性的降低有关^5）。此外还发现，若编码构成病毒颗粒结构的M、F和HN基因全部缺失，不仅会降低细胞毒性，还可完全避免二次颗粒的产生^6）。

另一方面，为推进将该载体应用于基因治疗和细胞重编程等领域，许多课题仍有待研究。例如，可在SeVdp载体搭载的基因结构有限，载体设计复杂，制造困难。此外，为了表达转录因子和各种受体，转录水平过高也是需要解决的问题。因此，从研发SeVdp载体的经验中吸取教训，我们着手研发更为通用的RNA载体，而研究的成果正是隐身型RNA载体（SRV）。

RNA病毒强烈诱导干扰素的原因之一在于病毒产生的RNA特性与动物细胞mRNA的特性显著不同，容易被识别为异物（病原体）。一般来说，RNA病毒的基因组RNA的GC含量较低，低于40%的不在少数。由于SeVdp载体的基因组RNA基本直接使用了天然存在的仙台病毒的遗传信息，其基因组RNA的GC含量约为46%，而人mRNA的GC含量约为60%。因为GC含量低的RNA会被细胞识别为异物^8），所以我们决定通过优化密码子，使用人为增添过GC含量的RNA来重建载体。

曾有研究称在慢病毒等病毒载体中尝试了利用优化密码子来增加GC含量，但即使编码蛋白的一级结构相同，修饰后作为病毒的功能也会明显受损，因此认为病毒基因组RNA很难大规模地改变碱基序列。因此，笔者在研发SRV时，将非编码区替换为人mRNA来源的序列，同时仔细谨慎地对每个基因进行编码区优化，最终成功利用密码子优化了转录和复制所需的全部载体来源的基因。

此外，为需要搭载的基因设定了简易的规则，无论采用任何组合、顺序，都能以“转录盒”式连接法搭载至SRV中。上述改进的结果就是成功地制备出了在生理水平上表达基因的载体，同时可搭载的基因数量和大小多至10个（最长有14 kbp），大大超越了现有技术 , 可作为通用载体应用于各种目的^9）。

◆可优化iPS细胞制备的隐身型RNA载体概述

SRV™ iPSC载体由常磐生物株式会社研发、富士胶片和光纯药销售，为了优化iPS细胞的制备，已采用了各种方法对其进行改进。例如，为尽可能地提高制备效率，根据作为重编程材料的细胞种类来改变载体的基因表达水平的同时，在适用于重编程血细胞的载体（SRV™ iPSC-2、SRV™ iPSC-4）中进一步改进并搭载了载体自动消除用的SeVdp-302L序列。此外，除了含有标准重编程基因组合（OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC）的4基因搭载型载体外，还设计了额外搭载有威斯康星大学的研究组曾报告过的NANOG和LIN28两种基因的6基因型载体，实现了超高效重编程。

图１．SRV™ iPSC 载体的基因组结构

SRV ™ iPSC-2和SRV ™ iPSC-4具有响应miR-302后自动消除载体的系统。这种机制对于用血细胞生产iPS细胞非常有效。

此外，所有SRV ™ iPSC载体都带有发出绿色荧光的EGFP（增强型绿色荧光蛋白，Enhanced Green Fluorescent Protein）基因，作为基因表达的标志物，在重编程过程中可用荧光显微镜轻松监测基因表达（图2 )。

图2. 使用SRV™ iPSC-2载体从外周血单细胞中构建iPS细胞

基因导入后第4天观察到EGFP荧光，证明该基因已被导入至几乎所有细胞中并已被表达。另一方面，在发生第一次传代前的第16天，已经出现了iPS细胞的集落，但几乎观察不到EGFP的荧光，由此可以确定载体已被自动消除。

根据以上改进，SRV™ iPSC载体实现了超越现有技术的重编程效率，即使是在Xeno-free、Feeder-free的严格要求下，也都能生产高质量的iPS细胞。特别是搭载有6因子的SRV ™ iPSC载体，对于需要高质量iPS细胞的再生医学来说是非常优秀的工具，并且针对自动制备iPS细胞等的应用仍在不断地改进。此外，只需改变搭载在SRV中的基因，即可兼容直接重编程（Direct reprogramming）、定向分化（Directed differentiation）等先进的细胞重编程技术，期待它能成为未来再生医学领域中被广泛使用的工具。

◆参考文献

 1）Davis, R. L. et al. : Cell, 51, 987 (1987). DOI: 10.1016/0092-8674(87)90585-x

 2）Takahashi, K. and Yamanaka, S. : Cell, 126, 663 (2006). DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024

 3）Yoshida, T. et al. : Virology, 92, 139 (1979). DOI: 10.1016/0042-6822(79)90220-4

 4）Yoshida, T. et al. : Virology, 120, 329 (1982). DOI: 10.1016/0042-6822(82)90034-4

 5）Nishimura, K. et al. : J. Biol. Chem., 282, 27383 (2007). DOI: 10.1074/jbc.M702028200

 6）Nishimura, K. et al. : J. Biol. Chem., 286, 4760 (2011). DOI: 10.1074/jbc.M110.183780

 7）Nishimura, K. et al. : Stem Cell Res., 23, 13 (2017). DOI: 10.1016/j.scr.2017.06.011

 8）Vabret, N. et al. : PLoS One, 7, e33502 (2012). DOI: 10.1371/journal.pone.0033502

 9）中西真人， 飯島実： 特許公報， 特許第6770224号

10）Yu, J. et al. : Science, 318, 1917 (2007). DOI: 10.1126/science.1151526

◆关键词

细胞重编程

血细胞和神经细胞都是由一个受精卵分裂且不可逆地分化细胞。由此，组成我们身体的细胞就具有了各种不同的功能和特性，一直以来人们都认为分化后的细胞其特性不会改变。然而MyoD基因的发现推翻了这一想法，揭示了分化细胞的特性可以人为改变。

持续感染

病毒与被感染的宿主细胞共存而不将宿主细胞杀死的一种感染状态。

诱导性多能干细胞（iPS细胞）

多能干细胞是指可分化成外胚层（皮肤和神经）、内胚层（消化道、肺、肝等）和中胚层（肌肉、血液等）的“多能性”细胞，在发现iPS细胞之前，更被人们熟知的是通过破坏人或动物发育过程中的胚胎而产生的胚胎干细胞（ES细胞）。然而ES细胞在破坏胚胎上存在伦理问题，若分化成ES细胞的细胞不使用免疫抑制剂就无法进行移植。另一方面，使用患者本人的细胞来制备iPS细胞，可在不发生免疫排斥的情况下进行移植，因此有望应用于再生医学。

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