由凝胶到动态检测的转变

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由凝胶到动态检测的转变

由凝胶到动态检测的转变

◆内毒素检测的意义

内毒素在环境中无处不在，主要在细菌裂解过程中由革兰氏阴性菌的外膜释放。若细菌内毒素通过肠胃外途径进入人体，可能会导致发生炎症、感染性休克、出血甚至死亡1。此外，在研究应用中，内毒素污染会导致结果不可靠并有可能产生误导性的解释。因此，内毒素检测已成为注射药物和医疗器械开发及质量控制的重要组成部分。


 


◆鲎试剂（LAL）检测作为内毒素检测法的首选

目前已研发出多种内毒素检测方法。其中，鲎试剂检测法被确立为内毒素检测的金标准试验2，3。LAL检测依赖于从鲎血液中提取的蛋白与样品孵育、反应从而分析内毒素含量。如果所测样品含有内毒素，LAL中的促凝血酶会与其发生相互作用，导致凝血级联反应的激活、变形细胞凝血原的修饰以及凝胶的形成。这被称为凝胶法或凝胶技术。对形成的凝胶进行可视化和定性评估。虽然凝胶技术灵敏且方便，但无法进行内毒素定量和高通量分析。因此，另外研发了定量LAL检测法。

◆动态鲎试剂检测的发展及优势

动态LAL检测具有显著优势，其可在广泛的浓度范围内定量内毒素含量并实现自动化分析，减少与用户有关的检测差异。内毒素定量可通过浊度（浊度LAL检测法）或反应混合物的颜色变化（显色LAL检测法）进行评估。浊度和显色LAL检测法均可用作动态和终点检测。


定量浊度LAL检测法

定量浊度LAL检测法可评估酶底物裂解后及凝胶形成前发生的浊度（浑浊）形成。使用分光光度计或酶标仪对浊度进行定量。定量浊度LAL检测法可靠、灵敏且能够与高通量分析兼容。


定量显色LAL检测法

显色LAL检测法依赖于显色底物的裂解，从而导致发色团的释放。然后，使用光度法对显色反应进行可视化和定量。 定量显色LAL检测法灵敏度高，可实现自动内毒素测量和高通量分析。


◆基于重组C因子的定量分析

另外还研发了可应用于内毒素定量检测的基于重组C因子检测法。所使用的重组C因子，是由内毒素诱导的鲎凝血级联反应的初始成分4。

◆转为动态LAL检测的注意事项

LAL检测已被广泛接受为内毒素检测的标准测试2，3。尽管LAL检测的所有变化都是灵敏、可靠的，但定量LAL检测和基于重组因子C的检测法，由于可提供定量和高通量内毒素的检测而越来越受欢迎。为内毒素检测选择合适的定量分析方法时5，应综合考虑分析样品的性质和特点、可用设备以及可能相关的法规要求等多种因素。

◆文献来源

  1. Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources 2018;52:115–120. https://doi.org/10.1016/j.anres.2018.08.002.

  2. Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.

  3. Mehmood, Y. What Is Limulus amebocyte lysate (LAL) and its applicability in endotoxin quantification of pharma products. Growing and Handling of Bacterial Cultures. IntechOpen 2019. Doi: 10.5772/intechopen.81331.

  4. Suvarna, K. Endotoxin detection methods – Where are we now?American Pharmaceutical Review. 2015, August 25.

  5. Wong J, Davies N, Jeraj H, Vilar E, Viljoen A, Farrington K. A comparative study of blood endotoxin detection in haemodialysis patients. Journal of Inflammation (London) 2016;13:24. doi: 10.1186/s12950-016-0132-5.