二噁英前处理柱制作过程和使用操作步骤
◆硅胶的活化
DCM（CH2CL2清洗硅胶）(进口的不需要清洗，国产的要清洗)
将硅胶装于玻璃柱中
↓
3倍于硅胶体积的甲醇清洗（大约800－1000mL的甲醇）
↓
同体积的DCM清洗（大约500ML的DCM）
↓
将硅胶置于铝箔纸上，通风厨过夜让溶剂挥发干净（或者N2吹干）
↓
马福炉中550℃烘烤至少12hrs,然后降温到180℃停留至少1hr
↓
取出在干燥器中降温后，转制烧瓶中加塞密闭，于干燥器中备用。
Note: 在玻璃柱中清洗时防止硅胶有断层出现
酸性硅胶的配制
30％酸性硅胶的配制
于烧瓶中称取100g活化硅胶
↓
于硅胶上逐滴滴入浓H2SO4共40g(硫酸密度为1.84g/mL)
计算公式为 x/(x+100)=30％， x=42.86g, 42.86/1.84=23.3mL
Note 边加边摇，以防结块，或置于摇床上至硅胶为均匀流动状态。
↓
置于干燥器中保存
若配制时用50g硅胶，那么H2SO4取11.65mL(大约为21.4g)
22%酸性硅胶：8mL浓H2SO4加50g活化硅胶
44%酸性硅胶：43mL浓H2SO4加100g活化硅胶
44%酸性硅胶：21.5mL浓H2SO4加50g活化硅胶
43×1.84/(100+43×1.84)= 44%
Note: 楼上的方法不能用于楼下，因为所用的硅胶不同，色谱行为就不同，即使柱形一样。因为楼上用的硅胶与楼下的不同，所以不能方法混用。楼上硅胶是国产，楼下的是进口的。
碱性硅胶的配制（1.2%）
100g活化硅胶
↓
滴入30g 1 N的NaOH(1N NaOH: 1.2gNaOH溶于30mL水)
注意：不要使硅胶沾到烧瓶的内磨口上，否则盖子关上后容易粘住打不开
↓
楼上用的是33%的碱性硅胶 （水＋NaOH）/(水＋NaOH+硅胶)＝33%
1g NaOH 加到25mL水里，即配制成了1mol/L的溶液，然后加入到50g活化硅胶中。
◆氧化铝
酸性氧化铝的活化
酸性氧化铝装于烧瓶中（体积不超过一半）
↓
用铝箔纸疏松的盖住瓶口
↓
在干燥烘箱中130℃过夜（至少12hrs）
↓
干燥器中加塞密闭
↓
干燥器中备用
碱性氧化铝
（最好在两周内使用，后者最好在5天内用完，否则易失活，可能需要重新活化）
碱性氧化铝盛于蒸发皿中
↓
马福炉中600℃烘至少24hrs
↓
降温到130℃停留至少3hrs
↓
干燥器中降温后转至烧瓶中，于干燥器中备用
弗罗里土：Florisil(硅酸镁)
150mm×5mmID小柱底部用玻璃棉轻轻塞住
↓
取1g 弗罗里土装于柱子中，并且轻轻拍动柱子让填料均匀沉降
↓
上层再装约1cm的无水Na2SO4
↓
50mL DCM清洗小柱
↓
卸去四氟阀，放于通风橱中过夜，让溶剂挥发干
↓
整个柱子置于干燥烘箱中，140℃至少24hrs
↓
如不使用则在140℃下存放
Note：使用时将柱取出降至室温，90分钟内使用，否则重新活化。
AgNO3 硅胶（10%）的配制
5.6g AgNO3溶于21mL超纯水中
↓
逐滴加入到50g活化硅胶中（或者11.2g AgNO3+35mL水+100g硅胶）
↓
用铝箔纸将装AgNO3硅胶的烧瓶全部包裹住，
烧瓶口用铝箔纸疏松地盖住，置于干燥烘箱中。
↓
烘箱中30℃烘5hrs(至少5hrs)
↓中间慢点升温
升温到60℃停留3hrs
↓
干燥器中降温后加塞密闭（保存在棕色干燥器中备用）
Note： 如果在制作过程中发现AgNO3硅胶颜色加深
或者局部变为灰黑色，应该弃去此次配制。变色原因：升温过快。
Note： 装AgNO3的小烧杯要尽快用超纯水洗净，
否则AgNO3会粘到烧杯上，不容易洗干净。
Na2SO4： 660℃下马福炉中烘至少6 hrs（优级纯）
注意：提取筒洗过后要在马福炉里420℃烘一段时间
纯化注意事项：
1. 所有纯化柱均采用干法装制；
2. 装好填料后轻拍柱子至填料表层平整；
3. 一旦加上洗脱液后，则不要再拍动柱子；
4. 一定量的hexane预淋洗进行稳定，并且除去部分污染杂质；
5. 预淋洗时流速控制在2滴/S;
6. 填料若出现断层则不能再使用；
7. 上柱样品后，用1mL正己烷清洗烧瓶；
8. 要等上一组分液面约1mm时再上样；
9. 若是做流出曲线，对体积要求就会严格一些，接流出物的量筒用铝箔包上，
防止溶剂挥发。
酸洗or酸性硅胶柱：1.5cm内径（15mmID）
结构式 －Si－O－
玻璃毛填充
↓
5g 44%酸性硅胶
↓
5g 22%酸性硅胶（这个是为了防止44%硅胶发生炭化）
↓
2g活化硅胶
↓
2 cm无水Na2SO4
↓
50mL—70mL的Hexane淋洗
↓
样品上样
↓
70mL—100mLHexane洗脱
↓
旋转蒸发至2—3mL
淋洗用的Hexane量由所加的硅胶量决定，若酸性硅胶（22%+44%）一共才10克，就不用100mLHexane洗脱，70mL足够，太多反而将杂质洗脱下来了。预淋洗用溶剂量也不一定要50mL—70mL,由硅胶量决定。
酸洗前一定要记住：一定要将溶剂置换为Hexane再酸洗。
硫酸硅胶柱净化容量不足，杂质易与dioxin 及PCBs竞争氧化铝及florisil的活性基位（Active sites），使dioxin 及PCBs在流洗过程中损失，降低了回收率。故acid silica要不能被穿透为止（由管柱的颜色外观可以判定是否被穿透）
Note：酸洗前，若样品溶剂为DCM，要将DCM置换成Hexane，CH2CL2不能与H2SO4混合，过酸性柱前将甲苯溶剂也要置换为Hexane,甲苯剩下的越少越好。
酸洗：（注意酸洗最多次数不要超过3次，否则影响回收率）
在溶液中加入15g酸性硅胶和搅拌磁子，在磁力搅拌器上搅拌30mins
↓
取上清液过无水Na2SO4小柱
↓
剩下的硫酸硅胶用10－20 ML的Hexane清洗两次（于磁力搅拌器上搅拌各10分钟）
↓
每次清洗后过无水Na2SO4小柱，一并收集
↓
合并后收集浓缩
酸性硅胶柱可以吸附许多离子或者非离子性官能基化合物，包括生物碱，糖脂，配糖物（醣），
染料，碱金属离子，脂质，甘油，类固醇，可塑剂，多环芳香族化合物及酚类衍生物等。
酸碱硅胶柱纯化（复合硅胶柱）30cm×15mmID
底部有200目玻璃砂芯和四氟磨口阀
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1g活化硅胶 ↓ 4g碱性硅胶 ↓ 1g活化硅胶 ↓ 8g酸性硅胶 ↓ 2g活化硅胶 ↓ 1cm无水Na2SO4 ↓ 100mLHexane预淋洗 ↓ 75mLHexane洗脱 |
1g活化硅胶 ↓ 4g碱性硅胶 ↓ 1g活化硅胶 ↓ 8g酸性硅胶 ↓ 1g活化硅胶 ↓ 2gAgNO3硅胶 ↓ 2cm无水Na2SO4 ↓ 100mLHexane预淋洗 ↓ 上样后用150mL (DCM/Hexane=5/95)洗脱 |
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楼下的方法 ： 先用100mLHexane预淋洗， 上样后用150mL洗脱。 DCM/Hexane＝5/95 |
楼上的方法 ： 先用70mL—90mLHexane预淋洗， 上样后，用100mLHexane洗脱。 |
注意：AgNO3硅胶不要加得太多，它对PCBs有吸附作用，AgNO3硅胶尽量称得准确些，它对流出曲线影响较大些（AgNO3有一定的极性）
分析PBDE时，要用铝箔纸将层析柱包上，防光（PBDE与AgNO3都要防光）
分析PBDE时是一样的柱子，一样的填料，洗脱是先100mLHexane预淋洗，上样后先用70mLHexane洗，弃去，再用70mL 1：1（DCM/Hexane）洗，这时洗下的就是含有PBDE的成分。
氧化铝纯化柱： 30cm×15mmID玻璃柱
旋蒸时留1mL左右，因为弗罗里土纯化柱太细，要减小上样的高度，洗脱时注意控制流速，不能太快，塞子不要垂直，倾斜既可
弗罗里土纯化柱： 柱型 150mm×5mmID
玻璃棉
↓
1g弗罗里土
↓
1cm无水Na2SO4
↓
50mL DCM清洗
↓
溶剂挥发（要卸下塞子）
↓
140℃下至少烘24hrs
↓
冷却后90min内使用（装上塞子）
↓
50mLHexane预淋洗
↓
35mL收集PCBs（30mL-35mL洗脱）DCM:Hexane(5:95,V:V)
↓
DCM（二氯甲烷）40mL-45mL收集dioxins
◆生物组织脂肪含量测定和去除
提取脂肪前烧瓶称重
↓
提取液转移至此烧瓶旋转浓缩近干后移至N2流下将多余溶剂吹走，直至天平称重无变化（百分位天平）
↓
称量提取后烧瓶重
↓
两次重量差即为脂肪
脂肪含量＝【（提取后烧瓶重－提取前烧瓶重）/提取样】×（1－组织水分百分含量）
↓
称脂后加50mLHexane溶解提取物
↓
15g酸性硅胶，搅拌磁子
↓
搅拌30mins
↓
过无水Na2SO4小柱
↓
5mLHexane清洗两次
↓
合并收集后浓缩
楼上氧化铝0.8 cmID,细柱，半湿法装柱
若是1.0cmID,则Al2O3用10g
柱中加30mLHexane
↓
8g Al2O3
↓
1cm Na2SO4
↓
预淋洗（30mL-40mLHexane洗脱）
↓
上样
↓
DCM/Hexane＝5：95 100mL洗脱PCBs
DCM/Hexane＝1:1 50mL洗脱dioxins
◆凝胶渗透色谱 GPC
填料： Bio-Beads SX3
GPC 柱型 30cm×25mmID(柱子下面有砂芯)
填料 30g于烧杯中
↓
加入DCM:Hexane（1：1，V：V）全部盖住
↓
铝箔纸盖住烧杯置于通风橱过夜，至少12hrs,填料充分溶胀
↓
搅动填料，并用吸管逐步将填料转移到柱中，中间打开四氟阀放去多余的溶剂
↓
全部转移后，上部留有10cm溶剂
↓
上端加塞，底部关阀
↓
整个柱子倒置后打开阀门
↓
振荡柱体，使填料逐渐整体均匀倒置
↓
关闭阀门，将柱子缓慢扶正，并且打开上面的磨口塞，可以看到填料均匀沉降直至完全
↓
应该无断层，无气泡，无沉降分界层
↓
500mL DCM：Hexane（1:1 ,V:V）淋洗，（注意要将溶剂混合均匀）
滴速 2－3滴/S
不用时关阀加塞密闭，上层留有5CM以上的溶剂，GPC使用溶剂均为DCM：
Hexane（1：1，V:V）若长时间没用，纯化前用100mL溶剂预淋洗
◆GPC洗脱
DCM：Hexane(1:1,V:V)
↓
100mL 预淋洗（量筒接）量筒1
↓
上样后，先用50 mL DCM：Hexane(1:1,V:V)去掉大分子（量筒接）量筒2
↓
另外量筒接70mL(DCM/Hexane=1/1)为PCB 量筒3
↓
另外量筒接50mL,量筒4
↓
量筒4与量筒250mL合并保存，以防重复实验时回收再分析
注意：
1．若GPC柱中物料层有气泡，则上面用塞子堵上，稍微晃一下柱子可以去除。若溶剂干了会造成断层。
2．GPC柱用前由于重心作用，上层发胀，所以需要释放一段洗脱溶剂，将发胀部分压下去，再上样。
◆N2吹
纯化后样品旋转蒸发
↓
转移入KD管后N2吹
↓
剩下0.2-0.3mL左右
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进样小瓶瓶芯中加15uL的壬烷
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Kd管中样品转移至瓶芯
↓
N2吹（温度不要太高30℃－60℃，太高有损失）
↓
洗KD管用DCM or Hexane至少洗2次，合并到进样小瓶瓶芯中
N2吹至瓶芯拐弯处上1mm－2mm处
↓
加入回收标保证进样小瓶中最后溶液约为20µL左右
↓
涡轮
注意 ：进样小瓶与瓶芯大小要搭配
加标前标准溶液需要提前从冰箱中拿出来平衡大约10几分钟
配制标准溶液： 举例
PBB标样转移到棕色小瓶A
↓
小瓶A用DCM清洗3次（涡轮）
↓
贴标签纸（标签纸不要贴太大，用透明胶贴一下）
↓
称空瓶重量W0
↓
将装标样的安培小瓶B按划线掰开
↓
DCM清洗一下滴管，晾干，用滴管将标样安培瓶里的标准溶液吸出转移入小瓶A
↓
称量装标后的小瓶与标的重量W1
↓
那么W1-W0即为取的标的重量
C18柱结构式： －Si－C18H37
目的：清除极性物质，ex: 蛋白，脂质
铜粉去S前铜粉的准备
铜粉置于烧瓶中
↓
6MHCL倒入清洗，不锈钢药勺搅拌
↓
倒掉HCL，超纯水清洗数次，洗净HCL为止
↓
倒入丙酮清洗数次，将水洗净
↓
将铜粉晾干备用（晾干的方法可以用N2吹干）
分析PBDE时所用的方法
1.5 g AgNO3装到柱子里（30cm×15mmID玻璃柱）
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50mL or 30 mL Hexane预淋洗
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100mL Hex洗PCB+dioxin
↓
50mL 10%DCM+90% Hexane洗PBDE
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