细胞葡萄糖摄取检测试剂盒 Glucose Cellular Uptake Measurement Kit

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细胞内葡萄糖吸收检测试剂盒细胞葡萄糖摄取检测试剂盒                              Glucose Cellular Uptake Measurement Kit

 

细胞葡萄糖摄取检测试剂盒                              Glucose Cellular Uptake Measurement Kit

 

 

◆原理

 

胰岛素是降血糖的激素,它能够以脂肪细胞或者骨骼肌等为中心促进糖输送活性,将糖从细胞外吸收到细胞内。

测定糖的吸收量一般是使用3H标记的3-O-甲基-D-葡萄糖和2-脱氧葡萄糖(2DG)的方法。这种方法需要用同位素,所以只能在RI管理区域内使用,在一般的实验室也无法使用。

本试剂盒使用安全,操作简单,用non-RI法能够简便地测定细胞内糖吸收量。

细胞葡萄糖摄取检测试剂盒                              Glucose Cellular Uptake Measurement Kit


 

试剂盒测定

 

细胞吸收的2DG会在己糖激酶的催化下会被2-脱氧葡萄糖-6磷酸(DG6P)氧化,不继续进行酶反应而是留在细胞内。

本试剂盒是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶反应下,生成2DG6P成比例地生成NADPH,然后NADPH发生氧化生成荧光基质后就可以测定荧光物质的荧光强度。

 

 

◆优点・特色

 

● 检测2-deoxyglucose (2DG) (葡萄糖类似物) 摄入的总量 

● 葡萄糖,2DG被细胞摄取后,在己糖激酶作用下,迅速磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(2DG6P)。

● 而2DG6P在细胞内聚集,不会发生进行代谢。

● 细胞裂解物中的2DG6P在耦合酶作用下,产生荧光信号,其强度与2DG6P的量正相关。

● 利用已知2DG6P的标准曲线,对照检测的荧光强度计算样品2DG水平

 


相关产品比较


【本试剂盒】

Measurement Kit, Broad Range, Fluorometric  

Cat. No. MBR-PMG-K01E

【相关产品】

2-Deoxyglucose (2DG) Uptake Measurement Kit

Cat. No. CSR-OKP-PMG-K01E

测定方法

Non-RI法

Non-RI法

操作时间

3小时

5~7小时(2天)

检测方法

荧光(Ex 540 nm/Em 590 nm)

发光(420 nm)

特征

测定范围广(0~50 μm)能够迅速进行测定

可以使用高通量法一步测定

高灵敏度(0~5 μm)定量检测试剂盒

 

 

◆案例・应用

 

试剂盒组成

 

试剂

规格

数量

储存(开封后)

2DG6P Solution (1 mM)

500 μL

3×3 mL

-20°C

(避光)

Sample Diluent Buffer Concentrate (100x)

5 mL

1 vial

Substrate Buffer

9 mL

1 vial

Fluorescent Substrate

120 μL

1 vial

Enzyme Solution

270 μL

1 vial

该试剂盒可进行100次反应

 


需要准备:


● 超纯水(蒸馏水)

● 2-deoxyglucose 建议产品

● 牛血清白蛋白建议产品

● 96-well黑色多孔板 

● 96-well荧光酶标仪 (激发波长540 nm/荧光波长590 nm)

● 超声波细胞裂解装置

 

 

胰岛素刺激3T3-L1细胞分化后2DG的摄取情况

 

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※具体操作见“相关资料”

 


胰岛素刺激3T3-L1细胞分化及样品制备

       对于您实验的细胞,需要根据细胞本身的情况优化培养基和各项条件,如实际浓度、培养时间及其他实验相关参数。
       以下是标准12孔培养板的3T3-L1细胞操作步骤。

试剂和培养基
・Serum-free culture medium
・Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) buffer at 37°C
(1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 118 mM NaCl, 5 mM KCl, 30 mM Hepes, pH7.5)
・BSA (essentially fatty acid free and globulin free grade, use Sigma Ca. No. A0281 or equivalent)


・2-Deoxy-D-glucose (2DG) solution
・ Insulin solution
・ PBS(-)
・Phloretin or Cytochalasin B (or other glucose uptake inhibitor)

细胞样品制备

1) Differentiate 3T3-L1 cells to adipocytes in a 12-well culture plate.

2) Replace culture media with serum-free medium. Return to incubator for 6 hours.

3) Gently wash cells 3 times with 1.5 mL of warm KRPH buffer without BSA?.

4) Gently add 3 mL of warm KRPH buffer containing 2% BSA.

加入胰岛素

5) For this example, insulin is added to a final concentration of 1 μm .

6) Incubate cells for 18 min at 37°C.

加入2DG

7) For this example, 2DG is added to a final concentration of 1 mM.

8) Incubate cells at 37°C for 20 minutes.

9) Wash cells gently 3× with cooled PBS containing 200 μM Phloretin to inhibit further 2DG uptake.

细胞裂解及样品制备

10) Add 1.5 mL of 1× Sample Diluent Buffer.and lyse cells by sonication with a microtip sonicator.

11) Collect cell lysate to tube, and apply heat treatment at 80°C for 15 minutes.
    Note: Do not add protease inhibitors to cell lysates.
    Note: If an alternate method for cell lysis will be used, do not use NaOH as NaOH degrades 2DG6P.

12) Centrifuge lysates at 15000 x g for 20minutes at 4°C

13) Transfer cell lysate supernatants to a fresh tube. These cell lysate supernatants are your experimental samples.
    Note: Supernatants can be stored at -20°C for later analysis.

检测细胞裂解液中的2 DG
   14) Follow the procedure of [Section III-1] “2DG Measurement Protocol” above.

【参考文献】


[1]

Yamamoto N, et al ,(2006). A nonradioisotope, enzymatic assay for 2-deoxyglucose uptake in L6 skeletal muscle cells cultured in a 96-well microplate. Anal. Biochem. 351: 139-145.


产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
CSR-MBR-PMG-K01E Glucose Cellular Uptake Measurement Kit (Broad Range, Fluorometric)
 细胞葡萄糖摄取检测试剂盒
100 tests

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