LipiORDER (Membrane Lipid Order Imaging Dye) 可定量观察活细胞的膜相态!

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可定量观察活细胞的膜相态!LipiORDER (Membrane Lipid Order Imaging Dye)                              可定量观察活细胞的膜相态!

LipiORDER <Membrane Lipid Order Imaging Dye>

LipiORDER (Membrane Lipid Order Imaging Dye)                              可定量观察活细胞的膜相态!

LipiORDER是环境响应型的荧光色素,可通过成像生物膜的相态 (Lipid order)Lo/Ld实现定量观察。即使在活细胞中也显示高度化学稳定性,且可观察到各种膜结构的相态,如细胞膜、细胞内膜等。

 本产品由funakoshi 株式会社基于高知大学教育研究部综合科复合领域科学部门 仁子阳辅博士的研究成果商品化并销售。

※ 本产品仅供研究,研究以外不可使用。

LipiORDER (Membrane Lipid Order Imaging Dye)                              可定量观察活细胞的膜相态!

LipiORDER成像和神经细胞染色示例

依赖生物膜相态的本试剂的荧光特性变化(左)和神经细胞神经突起部位的染色案例(右)

◆生物膜相态(Lipid order)是什么?


构成生物膜的脂质种类繁多,膜的状态因其脂质组成而大不同。例如,仅由饱和脂肪酸构成的脂质膜因密度高且包裹坚固的特点,被称为有序相(Lo);由含有不饱和脂肪酸脂质构成的脂质膜因密度低,被称为无序相(Ld)。像这样的脂质微环境被称为相态(Lipid order)。在简单模型中,Lo和Ld分离并发生明确的相分离(如图),但由于细胞生物膜中的脂质种类繁多,不会发生图中模型所示的简单相分离,而是反映总和性质的相态。

另外,膜蛋白的存在也被认为会影响相态,而实际细胞膜上的相态更为复杂。细胞膜上的Lo有时也被称为脂筏(Lipid raft),作为生物膜的功能域备受关注。这种脂质膜相态的观察对于理解膜的生物物理学性质(如生物膜的流动性和硬度等)非常重要,期待未来能开发出针对它的分析方法。

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脂质膜的相态成像

近年,Laurdan、di-4-ANEPPDHQ、Nile Red等响应分子极性并发生色调变化的荧光色素(solvatochomic dye) 已被应用于生物膜的相态可视化。由于这些分子极性响应型荧光色素会根据相态改变荧光波长,通过检测特定激发光中的两种波长的荧光获得其荧光强度比,可半定量分析相态。(详细信息,请参阅下述的“原理”)。

然而,这些试剂在实际使用中还存在如细胞内局部不均匀、对光不稳定等问题,。本产品LipiORDER利用高知大学的仁子阳辅博士和Strasbourg大学的Andrey Kylmchenko博士的团队开发的新型芘衍生物荧光探针(原著论文名PK),以及在Lo、Ld上荧光特性不同的特征,可定量分析生物膜相态。与Laurdan相比,显示极高的光稳定性,在活细胞中也能维持化学稳定性,因此活细胞成像优异。

 


参考:膜的相态成像应用实例


相态被认为是决定脂质膜流动性的参数,以Laurdan为首,相态成像被用于各种生命现象的分析。Laurdan会根据相态将荧光波长由蓝色(Lo)变为绿色(Ld),观察蓝色和绿色两种波长的荧光,其荧光强度比(绿色荧光强度/蓝色荧光强度)和GP值(generalized polarization;(Fblue-Fgreen/Fblue Fgreen)的计算值可用于评价相态。例如进行外部刺激(药物处理、氧化应激等)、基因操作(目的基因的过表达或敲降)引起的细胞形态结构变化及其相态的分析。此外,作为细胞功能分析的一环,还观察到了细胞类型间的相态比较。

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Laurdan:在观察到两种波长的荧光后,从观察图像中计算出荧光比(或GP值),使用拟色进行比率型图像分析。

◆原理


LipiORDER是根据溶剂的分子极性改变荧光特性的溶剂极性响应型荧光色素(Solvatochromic fluorescent dye)(图1)。此外,本试剂对脂质膜具有高亲和性,浓缩在细胞的膜结构中。通过这两个特点,本试剂根据膜内部的极性将荧光由绿色变为红色。相态反映了脂质的包裹密度,稀疏包裹的Ld极性高,而紧密包裹的Lo极性低,通过观察膜结构的极性可定量观察相态(图2上)。实际上,与模型Lo相(sphingomyelin/Cholesterol; SM/Chol)显示绿色荧光(荧光波长最大~510 nm)相对,模型Ld相(dioleylphosphatidylcholine;DOPC)发生长波长偏移,显示红色荧光(荧光波长最大~575 nm)(图2下)。另外,在被认为是SM/Chol与DOPC中间模型的DOPC/Chol中,观察到SM/Chol与DOPC中间的荧光光谱,可通过观察本试剂获得的绿色荧光强度FG(荧光显微镜中的检测波长范围约为500~550 nm)和红色荧光强度FR(检测波长范围约550~650 nm)的荧光强度比FR/FG,相对定量膜相态。

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图1. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性

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图2. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性

上图:根据相态的荧光特征变化图  下图:模型脂质体中的荧光光谱

◆特点


● 由405 nm激发产生的绿色荧光强度FG(500~550nm)和红色荧光强度FR(550~650nm)的荧光强度比FR/FG和相态之间存在相关性。

● ※ 本试剂几乎不被488 nm激光吸收,可作为激发488 nm以上的光的荧光色素使用。

● 显示出的性质:荧光比FR/FG的值越大,则越接近无序相Ld状态;FR/FG值越小,则越接近有序相Lo状态。

● 极性响应型荧光色素,在低极性环境中发出荧光。在水溶液中不发出荧光,在高S/N比下可观察到膜结构和脂肪滴。

● 只需将本试剂添加至活细胞中,即可摄入至细胞膜、内膜和脂肪滴,并会根据膜的相态表现出不同的荧光特性。

● 拥有脂质体模型、培养细胞和斑马鱼的染色实绩。

● ※ 有关斑马鱼的染色情况,请参考原著论文。

● 已确认本试剂的荧光特性几乎不受蛋白、多糖等的影响。

● 与现有的分子极性响应型荧光色素Laurdan相比,显示更高的光稳定性。


 

 

◆原著论文


Valanciunaite et al., Anal. Chem., 92, 6512-6520 (2020) Polarity Mapping of Cells and Embryos by Improved Fluorescent Solvatochromic Pyrene Probe.

 

 

◆观察注意事项


生物膜相态是通过荧光比来定量的,所以需要检测在405 nm激发下的两种波长的荧光。同时在Green频道约500-550 nm和Red频道约550-650 nm获得荧光,再使用各种分析软件算出荧光比。为获取荧光比,在每次荧光观察时需注意不能使信号饱和。这种色素在488 nm、560 nm处不吸收,所以可与一般的绿色、红色和近红外荧光发生共染色。建议获取以下溶液的荧光图像作为校准对照:

油(Labrafac oil)

脂肪滴检测标准

Sphingomielyne/Cholesterol

Lo标记

DOPC

Ld标记

◆应用数据


■ 活细胞成像


添加LipiORDER(300 nM in HBSS)至COS7细胞中,培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像(激发光:405 nm;荧光Green:470-550 nm,Red:550 nm~)。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析(荧光比FR/FG),并用假色(LoLd)可视化相态。细胞膜的FR/FG低,估计在ER等细胞内膜中FR/FG高。

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Heat map的详细分析结果。

将比率测量分析图像的各个热图层抽出,并分析。


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■ 观察神经细胞膜的相结构

添加LipiORDER(300 nM in HBSS)至E17.5小鼠来源的海马原代神经细胞(DIV3或DIV12)中,培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光成像(激发光:405 nm、荧光Green:470~550 nm,Red:550 nm~)。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行分析(荧光比FR/FG),并用假色(LoLd)可视化相态。通过比率测量分析,可观察到在所有膜结构中,细胞膜的FR/FG低,与Lo的环境接近;内膜结构的FR/FG高,与Ld的环境接近。

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■各个图像的荧光观察图像以及比例分析的应用。


在激光共聚焦显微镜的405 nm激发光下,使用绿色荧光图像(470-550 nm)和红色荧光图像(550 nm以上),并通过ImageJ算出比率测量分析图像。


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将比率测量分析图像的疑似色热图阶段性分割,可以看出,FR/FG(接近Lo)的信号,随着荧光比率不断增大(接近Ld),会距离细胞膜越来越远。

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■ 观察依赖于细胞外刺激的膜相态变化


用胆固醇去除剂的β-cyclodextrin(β-CD; 15 mM)处理COS7细胞4 h,清洗细胞,并添加LipiORDER(300 nM in HBSS),培养细胞10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像(激发光:405nm,荧光Green:470-550nm,Red:550nm~)。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析(荧光比FR/FG),并用拟色(LoLd)可视化相态。通过β-CD处理可观察到细胞结构的显著变化,提取热图的深绿色层(荧光比0.06-0.34)时,发现其分布发生了很大的变化。

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※ 上述细胞染色数据,由名古屋市立大学大学院 药学研究科 服部光治教授提供。

■ 光稳定性


比较现有的分子极性检测试剂Laurdan和LipiORDER的光稳定性。与Laurdan表现出显著的光衰减相比,LipiORDER即使在暴露1 h后仍保持稳定。该试剂也可用于长期成像。

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产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
FDV-0041  LipiORDER(Membrane Lipid Order Imaging Dye)
LipiORDER(膜脂质序成像染料) 
0.1 mg