混合技术利用 Ni-NTA-Nanogold® 阐明亚蛋白结构， 揭示关键基因转录机制

迄今为止，许多生命过程背后的确切机制仍然难以捉摸，因为我们“观察”蛋白质微小部分及其相互作用的方法受到限制。现在，一种新的混合技术利用了电子显微镜、纳米技术、复杂的图像处理和 3D 绘图软件以及标记和测量蛋白质的方法的力量。突破性的方法是从读取 DNA 本身的物理启动开始，揭示我们最微小的运动部件的结构和功能。

转录对于细胞基因的表达至关重要，即“读取”DNA 片段以开始产生所需的蛋白质。其中一个关键角色是 RNA 聚合酶 II（RNAPII），它是一种从起始 DNA 合成信使 RNA 的纳米机器。同样重要的是它的助手 TFIIF，它可以识别 DNA 启动子并向 RNAPII 发出信号，从哪里开始读取一定长度的遗传密码。到目前为止，这对动态二人组相互作用背后的机制仍然难以捉摸，因为太小而无法可视化。

在中国台湾，Wei-hau Chang 博士和他的团队开创了一种混合技术，对这些重要蛋白质复合物的解剖结构和功能产生了深入的认识。他们超越了冷冻电镜和 X 射线晶体学的界限，使用一种新颖的电子显微镜成像技术进行单颗粒分析，然后通过 FRET 分析进行微小测量，以进一步提高其绘图的精度。他们的发现不仅解开了 TFIIF 在 RNAPII 上的位置之谜，而且还揭示了这些是移动部件，发生戏剧性的转变以与 DNA 结合——让我们第一次看到基因转录的物理起始过程。

当他们着手研究由 TFIIF 和 RNAPII 形成的 DNA 读取复合物的结构时，Chang 等人。需要用更明显的标签来标记难以看到的蛋白质，然后可以用它来确定它们的确切位置。他们首先用 Nanogold®（一种单一的金纳米颗粒）标记 TFIIF 蛋白的末端；黄金的电子密度很高，因此在电子显微镜下会显得明亮。该团队利用酵母中的基因表达技术，在 TFIIF 上创建了带有 10 个组氨酸的 TAP 标签，然后该标签与 Nickel-NTA-Nanogold ® (Nanoprobes Inc.)紧密结合，为他们的 EM 工作提供了清晰的标记。

分析的第一阶段结合了两种成像方法和电子显微镜。更加散焦的视图实际上增加了与较大物体的对比度，从而使蛋白质复合物整体成形；对于这组图像，该小组使用了更大的 5 nm Ni-NTA-Nanogold 标记物。接下来，使用高度聚焦的图像清晰地识别出单个微小的金纳米颗粒；在这里，该小组使用 1.8 nm Ni-NTA-Nanogold 以最高精度标记他们的目标。两个视图共同形成了一幅图像，显示了微小 TFIIF 转录起始子的位置，以及它如何融入更大的 RNAPII 转录机器。软件分析了数千个图像对，创建了详细的蛋白质 3D 图谱。

第二阶段的分析使用 FRET 分析带来了更高的精度。在这里，荧光“发射机”标记被放置在 RNAPII 转录机上的稳定点，“受体”标记被放置在 TFIIF 蛋白上。一段时间后，接收器收集到的能量可以用来计算其与发射器的准确距离。对许多样品的分析进一步完善了 TFIIF 蛋白在 RNAPII 复合物上的定位，结合 EM 数据创建了详细的图谱。

然而，Chang 的团队所做的远不止简单地绘制这些蛋白质的孤立结构。他们还展示了带有基因序列的起始前转录复合物，并使用他们的方法来检查 TFIIF 起始子在遇到 DNA 启动子时的定位。他们发现 TFIIF 会做出剧烈的物理运动作为响应，这实际上将 DNA 移向 RNAPII 转录机的叶/突出区域。这可能代表了转录起始位置的动力学选择，并且是在行动中观察到的基本生命过程开始背后机制的第一个视图。

作者写道：“我们相信这种方法对于研究许多蛋白质复合物的结构和动力学通常很有用。”他们将他们的两步过程比作“用谷歌地图放大”。事实上，张的团队已经找到了一种方法来“看到”我们至关重要的纳米机械中极其微小的部分，从而可以真正了解它们在创造和支持生命本身时的相互作用和功能。

“这种结合了多种技术的新技术确实为更深入地了解细胞过程如何工作打开了大门，” Nanoprobes 的科学家James F. Hainfeld 博士说，该公司是Chang 技术中使用的Ni-NTA-Nanogold ®的制造商。 “这是一个以高分辨率绘制蛋白质结构图的好工具。”