高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性,全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的,其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒(AAV)载体常被用于基因治疗,而慢病毒(LV)载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的,而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一,对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物,如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内,但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步,但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此,优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感,从中筛选出适合病毒生产的混合配方,将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力,Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂,它不仅仅是基于PEI或脂质体,而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物(LPNC),能够高效地结合和包裹DNA,将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中,然后将其从细胞核内释放,以便同时满足2-4个不同的质粒的表达,这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时,Mirus还研发出了一种完全合成的(无动物源)转染增强剂(Enhancer),与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时,可以进一步提高病毒滴度。另外,为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求,Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品,以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明,Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台(贴壁和悬浮)、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比,在不使用增强剂的情况下,病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后,在合适的培养条件下,病毒产量甚至能够提高10倍以上!(结果见下图1-5)

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图1. 基于脂质聚合物纳米复合物(LPNC)和聚乙烯亚胺(PEI)配方的转染试剂用于腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体生产的性能对比。分别用基于LNPC的TransIT-VirusGEN试剂(不含增强剂与含增强剂)、25kda PEI和基于PEI技术的竞争品牌A3转染试剂产生AAV(左)和LV(右)。以LPNC为基础的TransIT-VirusGEN转染试剂比以PEI为基础的转染试剂的病毒颗粒表达量高3-5倍。当TransIT-VirusGEN和增强剂同时使用时,比单独使用TransIT-VirusGEN大约提升了一倍。转染试剂 : DNA的比值为体积 : 质量。

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图2. TransIT-VirusGEN转染试剂在不同细胞培养基中的表现。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生产细胞进行转染,该细胞适应四种不同的培养基配方,分别来自Thermo Fisher公司的LV-MAX培养基、Expi293表达培养基、FreeStyle F17表达培养基和来自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培养基。后一种培养基的AAV总效价较高,但在所有使用的培养基中,无论是否添加增强剂,TransIT-VirusGEN转染试剂均表现优异。DNA与转染试剂配比为2μg DNA :3μl转染试剂,转染细胞密度为2.0×106个/ml。生产LV也获得了类似的结果(数据未显示)。

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图3. 分别在四种不同的转染条件和两个不同的收获时间,测定TransIT-VirusGEN转染试剂和PEI为基础的转染试剂A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F细胞生产AAV2-GFP。转染48小时和72小时后收获的病毒分别测定功能滴度TU/mL(左)和物理滴度GC/mL(右)。结果显示用TransIT-VirusGEN转染试剂和增强剂转染收获的病毒效价最高。此外,TransIT-VirusGEN转染试剂比PEI为基础的转染试剂的表达更快。这些结果表明,对于病毒滴度的评估,功能滴度可能是一个更可靠的指标。因此,建议测试几个不同的收获时间点来确定最佳方案。

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图4. 每种培养体系都应优化转染时的细胞融合度和接种密度。用DMSO+10%胎牛血清培养贴壁的HEK293t/17细胞生产慢病毒(1μg DNA/mL)。试剂盒包括TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN LV复合物形成溶液和VirusGEN LV增强剂。

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图5. 在Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞,使用VirusGEN AAV转染试剂盒,内含TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN AAV复合物形成溶液和VirusGEN AAV增强剂,在悬浮细胞培养中生产AAV。分别用2:1(左)和3:1(右)两种比例来确定理想的转染试剂和DNA配比(体积:质量)。每种转染体系都应对转染试剂: DNA配比及每毫升细胞所需的总DNA量进行优化。

TransIT-VirusGEN转染系列产品信息

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美国Mirus公司成立于1995年,是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司之一,同时也是目前该类试剂主要的供应商之一。Mirus被公认为转染试剂开发的领跑者,其许多杰出成果获得世界公认与广大用户的好评。

上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务。如果您对上述产品感兴趣,欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息或申请试用。

引用文献:

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

(https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf)

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

腺相关病毒AAV具有表达滴度高、宿主免疫反应轻微、感染谱广、安全性高等优势,成为近年来在基因治疗领域应用广泛的病毒载体之一。上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs (AAV Helper Free Expression System)的AAV三质粒表达系统也是目前常用的一类AAV载体系统。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

如下图所示,该套AAV系统包含表达载体(Expression vector)、包装质粒(Rep-Cap plasmid)和辅助质粒(pHelper plasmid)。其中表达载体是AAV病毒的核心,包含了ITR序列、CMV启动子、多克隆位点等,用于携带外源基因;包装质粒负责表达AAV病毒的结构蛋白,决定AAV的血清型和组织嗜性。由于野生型AAV是复制缺陷型的,必须依赖辅助病毒(如腺病毒)才可以感染靶细胞。AAV Helper Free Expression System利用在不同质粒上提供这些必要的辅助基因来确保重组AAV病毒具有感染性,消除AAV对辅助病毒的依赖,解决了AAV生产过程中要去除腺病毒污染的难题。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

      Expression vector包含ITR序列,多克隆位点,携带目的基因;

      Rep-Cap plasmid包含Rep和Cap基因,决定了重组AAV的血清型和组织嗜性;

      pHelper plasmid 包含腺病毒的VA、E2A和E4基因,使重组AAV具有感染性。

  1. AAV表达载体

AAV基因组为4.7kb,能够携带的外源基因上限在4kb左右。Cell Biolabs提供了8种AAV的表达载体,兼容常用的各种AAV包装系统,表达载体都携带有2个ITR序列,使AAV基因组能正确形成T-形二级结构,进而保证了病毒的有效复制和包装。载体上有氨苄抗性基因、多克隆位点,还可以根据实验需要选择带标签、无标签、不含启动子或自身互补型(self-complementary)AAV表达载体(产品详情如下表)。

货号

质粒名称

载体容量(kb)

特征

VPK-415

pAAV-IRES-Puro

1.8

Puro标签

VPK-416

pAAV-IRES-Neo

1.6

Neo标签

VPK-417

pAAV-IRES-Hygro

1.4

Hygro标签

VPK-418

pAAV-IRES-GFP

1.7

GFP标签

VPK-419

pAAV-IRES-Bsd

2

BSD标签

VPK-410

pAAV-MCS

3

无标签

VPK-411

pAAV-MCS Promoterless

4

无启动子

VPK-430

pscAAV-MCS

1.5

self-complementary

  1. AAV包装质粒

AAV共有12个血清型,其中AAV1-6是从人类组织中分离获得,并且具有明确的的抗体反应性,是目前常用的经典AAV载体。尽管不同血清型AAV都具有正二十面体结构,但其衣壳蛋白在序列与空间构象上的多样性,使得AAV与不同细胞表面受体亲和力及组织嗜性存在显著差异。在感染嗜性方面,AAV-2的感染谱较广应用较多,AAV-1在骨骼肌中的转导效率较高,AAV-3易于转导巨核细胞,AAV-5和AAV-6感染呼吸道上皮细胞的优势较为显著。因此,根据AAV不同血清型在组织感染性的相对特异性,可以用于在针对不同靶向组织的基因治疗中寻求最佳的AAV载体类型与组合。除了常见的六个血清型AAV之外,Cell Biolabs还提供两种重组型AAV包装质粒即AAV-DJ与AAV-DJ-8,如下图所示,这两种AAV的Rep-Cap基因是由多个野生型AAV的结构基因重组而来,与其他野生型相比,AAV-DJ在体外细胞转导效率更高,AAV-DJ-8则更适用于体内感染实验。

cell biolabs腺相关病毒(AAV)载体

以常用的AAV-2为参照,下表比较不同血清型AAV对种属、组织细胞的感染率。值得一提的是,AAV-DJ对不同物种的肝细胞、黑色素瘤细胞以及胚胎干细胞的感染能力都有绝对优势,甚至高于常用的AAV-2。

辅助质粒pHelper plasmid是确保重组AAV具有感染性的重要质粒,pHelper载体中包含了腺病毒的E2A、E4基因和VA RNA,由于我们常用的AAV包装细胞系293和293T都含有E1基因,因此该系统中的pHelper质粒上没有再提供E1基因。

AAV包装质粒货号(Rep-Cap&pHelper plasmids)

VPK-401

VPK-402

VPK-403

VPK-404

VPK-405

VPK-406

VPK-400-DJ

VPK-400-DJ-8

细胞系

组织类型

AAV-1

AAV-2

AAV-3

AAV-4

AAV-5

AAV-6

AAV-DJ

AAV-DJ/8

Huh-7

人肝脏

13

100

2.5

0.0

0.1

10

500

0.2

HEK293

人肾脏

25

100

2.5

0.1

0.1

5

500

0.3

HeLa

人子宫

3

100

2.0

0.1

6.7

1

667

0.2

HepG2

人肝脏

3

100

16.7

0.3

1.7

5

1250

0.5

Hep1A

小鼠肝脏

20

100

0.2

1.0

0.1

1

400

0.1

911

人视网膜

17

100

11

0.2

0.1

17

500

0.0

CHO

仓鼠卵巢

100

100

14

1.4

333

50

25000

5.0

COS

非洲绿猴肾脏

33

100

33

3.3

5.0

14

500

0.3

MeWo

人皮肤

10

100

20

0.3

6.7

10

2857

1.0

NIH3T3

小鼠成纤维

10

100

2.9

2.9

0.3

10

500

0.1

A549

人肺脏

14

100

20

ND

0.5

10

1000

0.1

HT1180

人成纤维

20

100

10

0.1

0.3

33

333

0.2

Monocytes

人原代单核细胞

1111

100

ND

ND

125

1429

100

ND

Immature DC

人树突细胞

2500

100

ND

ND

222

2857

200

ND

Mature DC

人树突细胞

2222

100

ND

ND

333

3333

100

ND

ND = Not Determined

上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌除了提供AAV病毒的全套载体系统外,还有腺病毒(Adenovirus),慢病毒(Lentivirus)和逆转录病毒(Retrovirus)载体系统,为广大科研用户提供了高效、便捷的病毒载体产品库,小编之后还会一一为大家介绍这些病毒载体,敬请期待!

上海金畔生物科技有限公司作为Cell Biolabs中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为广大生物科技领域科研与企业客户提供高品质产品与优质服务,如果您对上述产品感兴趣,欢迎随时拨打全国客服热线021-50837765或登录上海金畔生物科技有限公司官方网站www.jinpanbio.cn查询订购!

逆转录病毒克隆载体-重组反转录病毒表达载体

逆转录(也成为反转录病毒,Retrovirus)病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒载体在构建时,删去了pol、env基因和gag基因的3′端,但保留了病毒颗粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高载体的安全性,防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样,反转录病毒载体就可利

Vector Names Catalog Number
pBABEhygro RTV-001-HYGRO
pBABEneo RTV-001-NEO
pBABEpuro RTV-001-PURO
pMCs-IRES-GFP RTV-040
pMCs-Puro RTV-041
pMXs RTV-010
pMXs-IRES-Blasticidin RTV-016
pMXs-IRES-GFP RTV-013
pMXs-IRES-Neo RTV-015
pMXs-IRES-Puro RTV-014
pMXs-Neo RTV-011
pMXs-Puro RTV-012
pMYs RTV-020
pMYs-IRES-GFP RTV-021
pMYs-IRES-Neo RTV-023
pMYs-IRES-Puro RTV-022
pMYs-Puro RTV-024
pMZs RTV-030

用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随机整合到宿主细胞基因组内,这种载体还在不断改进之中。

逆转录表达载体种类较多,根据其基本载体骨架分为pBABE、pMCs、pMXs、pMYx等,又有不同筛选标记,hygro(潮霉素)、neo(新霉素)、puro(嘌呤霉素)、Blasticidin(杀稻瘟素)等。很多逆转录病逆转录病毒克隆载体-重组反转录病毒表达载体毒载体包括pBABE和pMXs都是基于莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV),这种逆转录病毒载体在一些非成熟细胞里面被沉默表达,如胚胎瘤细胞、胚胎干细胞和造血干细胞,因此适应面受到限制。而骨髓瘤病毒(MPSV)和PCC4细胞来源的骨髓瘤病毒(PCMV)是MMLV的变种,能很好的在上述非成熟细胞内稳定表达。

Cell Biolabs的pMCs 、pMYs和pMZs都在MMLV启动子的基础上又加上了PCMV或MPSV启动子,后者能使逆转录病毒在EC肿瘤干细胞和ES胚胎干细胞内更稳定表达。特别的,pMYs系统更适合于造血干细胞中的外源基因表达,pMC则更适合在EC和ES细胞内使用。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒表达载体—Cell Biolabs重组逆转录病毒克隆载体

逆转录病毒载体是常用的病毒载体之一。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内,这种整合的位点是随机的。逆转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。

产品名称 货号(点击查看说明书)
pBABEhygro RTV-001-HYGRO
pBABEneo RTV-001-NEO
pBABEpuro RTV-001-PURO
pMCs-GFP RTV-051
pMCs-IRES-GFP RTV-040
pMCs-Puro RTV-041
pMXs RTV-010
pMXs-IRES-Blasticidin RTV-016
pMXs-IRES-GFP RTV-013
pMXs-IRES-Neo RTV-015
pMXs-IRES-Puro RTV-014
pMXs-Neo RTV-011
pMXs-Puro RTV-012
pMYs RTV-020
pMYx-GFP RTV-052
pMYx-IRES-GFP RTV-021
pMYs-IRES-Neo RTV-023
pMYs-IRES-Puro RTV-022
pMYs-Puro RTV-024
pMZs RTV-030

逆转录病毒是一类正链RNA病毒,其分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别,并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内;同时逆转录病毒结构基因gag env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性,因此可用外源性基因代替这部分病毒基因,外源性基因较大容量为8.0kb左右,可适用于大部分目的基因;并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中,这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。

目前较常用的逆转录病毒载体为Moloney小鼠白血病病毒改建的各类逆转录病毒载体,逆转录病毒载体其他部分为细菌质粒pBR322基因,便于病毒载体体外大量扩增。Cell Biolabs提供几十种逆转录病毒表达载体。根据其根据其基本载体骨架分为pBABE、pMCs、pMXs、pMYx等;又有不同筛选标记供选择,hygro(潮霉素)、neo(新霉素)、puro(嘌呤霉素)、Blasticidin(杀稻瘟素)等。

Cell Biolabs的逆转录病毒载体pBABE和pMXs都是基于莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV),这种逆转录病毒载体在一些非成熟细胞里面被沉默表达,如胚胎瘤细胞、胚胎干细胞和造血干细胞,因此适应面受到限制。而骨髓瘤病毒(MPSV)和PCC4细胞来源的骨髓瘤病毒(PCMV)是MMLV的变种,能很好的在上述非成熟细胞内稳定表达。Cell Biolabs的pMYXs、pMYs、pMCs和pMZs都在MMLV启动子的基础上又加上了PCMV或MPSV启动子,后者能使逆转录病毒在EC和ES细胞内更稳定表达。特别的,pMYs系统更适合于造血干细胞中的外源基因表达,pMC则更适合在EC肿瘤干细胞和ES胚胎干细胞内使用。

逆转录病毒表达载体—Cell Biolabs重组逆转录病毒克隆载体

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒包装细胞系—铂金版Plat-E/Plat-A/Plat-GP系列

逆转录(也成为反转录病毒,Retrovirus)病毒载体是常用的病毒载体之一。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内,这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。

逆转录病毒通过整合进目的细胞基因组,能实现持久的表达,而且几乎没有免疫原性,因此很受欢迎。特别是和腺病毒相比,其能整合进基因组的优势导致逆转录病毒也被广泛应用,然后逆转录病毒系统也存在一定的缺陷,首先是安全性比较低,因为所有包装所需的基因都放到一个载体上,还有就是基因能整合进目的细胞也可能会导致细胞基因组的紊乱,而且其滴度比较低。由于逆转录病毒表达系统的特殊性,其包装细胞的种类较多,表达载体的种类也较多,因此需要根据不同的实际来选择合适的表达系统。Cell Biolabs的逆转录病毒表达产品包括包装细胞系、表达系统(同时包括了包装细胞和表达质粒载体)、逆转录病毒表达质粒以及插入了目的基因的重组逆转录病毒表达质粒。

逆转录病毒包装细胞系—铂金版Plat-E/Plat-A/Plat-GP系列Cell Biolabs提供三种铂金版逆转录病毒包装细胞系:单嗜性(Ecotropic)Plat-E包装细胞系、双嗜性(Amphotropic)Plat-A包装细胞系及泛嗜性(Pantropic)Plat-GP包装细胞系。它们对不同的细胞具有不同的侵染性。

Plat-E包装细胞系(Ecotropic)是一种来源于人胚肾(Human Embryonic Kidney, HEK)293细胞系,主要用于快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒,同时也能用于稳定地产生逆转录病毒。由Plat-E包装细胞系产生的病毒表达一种单嗜性的被膜,因而只能感染小鼠和大鼠细胞。Plat-GP包装细胞系(Pantropic)也来源于HEK293,但却是一种泛嗜性的包装细胞系,其包装产生的逆转录病毒颗粒既能感染哺乳动物细胞,也能感染非哺乳动物细胞。在使用过程中, Plat-GP细胞需要用逆转录病毒载体和pVSV-G来共转染。VSV-G是泡状口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus) 的被膜糖蛋白,能通过脂质结合及质膜融合来介导病毒进入细胞。因此在使用Plat-GP细胞系时,还需要额外的使用pVSV-G完成包装。Plat-A包装细胞系(Amphotropic)也是一种来源于HEK293细胞的细胞,在将病毒env 基因导入该细胞时利用嘌呤霉素作为选择标记,因而对于一些使用嘌呤霉素作为筛选标记的载体无法使用。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic RV-101 单嗜性逆转录包装细胞系,包装病毒可感染小鼠、大鼠,一个包装>3 x 106细胞
Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic RV-102 双嗜性逆转录包装细胞系,包装病毒可感染小鼠、大鼠、人,一个包装>3 x 106细胞
Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic RV-103 多嗜性逆转录包装细胞系,包装病毒感染宿主范围非常广,但是需要额外提供VSVG蛋白,>3 x 106细胞
pVSV-G Packaging Vector RV-110 提供VSVG包膜蛋白

一般来说,Plat-E是最常用的逆转录病毒包装细胞;Plat-GP则是适用性最广的逆转录包装细胞(但是需要多增加一个表达载体pVSV-G Packaging Vector提供外壳蛋白VSV-G,该外壳蛋白宿主范围非常广);Plat-A用的比较少,但是其宿主范围比Plat-E要多一些,比如可应用于人、猴、狗来源的细胞等。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺相关病毒转染——Cell Biolabs腺相关病毒高效转染试剂

安全高效的将目的基因导入人体靶细胞是成功进行基因治疗的关键之一。经典的基因导入方式(如显微注射、电穿孔、磷酸钙转染等)虽然曾在科研中起了一定的作用,但由于不能很好的解决转染率、靶向性等问题而限制了它们的应用。随着病毒学等相关学科的发展,目前基因打靶已广泛使用各种病毒为载体,AAV载体是最近几十年发展起来的一类新型载体。作为病毒载体的重要一员,AAV不具有明显的细胞毒性效应并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应等特性,因为其在基因治疗中的应用潜力引起了人们越来越多的兴趣和关注。

由于AAV是天然的缺陷性病毒,需要提供多个因素才能导致转染发生,因此也被认为是最安全的病毒载体。同时腺相关病毒能感染分裂型和非分裂型细胞,甚至S期静止细胞,这使腺相关病毒成为很有前途和吸引力的基因治疗载体。腺相关病毒的转导过程包括病毒结合、进入细胞以及进入后的作用、核内转移和病毒第二条DNA链的合成。在这过程中,最后一步,也就是AAV第二条DNA链的合成是腺相关病毒载体转染的限速步骤。腺相关病毒转染——Cell Biolabs腺相关病毒高效转染试剂

Cell BioLabs针对腺相关病毒转染过程中的主要问题,开发出ViraDuctin™腺相关病毒转染试剂(ViraDuctin™ AAV Transduction Kit 目录号:AAV-200/AAV-201)。该试剂盒能高效提高腺相关病毒在多种细胞内的转染效率,包括传统转染方法转导较低的细胞非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。该转染试剂使用便捷,只需2小时,是AAV转染非分裂细胞的首选。该试剂盒按照可转染次数分两种包装,AAV-200能进行10次6孔板或者35mm细胞培养皿的转染,货号为AAV-201的则能进行50次转染。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
ViraDuctin™ AAV Transduction Reagent AAV-200 10次6孔板/35mm细胞转染
AAV-201 50次6孔板/35mm细胞转染

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺相关病毒相关产品和服务,产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术,无需超速离心,在大大减少试验时间的同时还保证了AAV的纯度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺相关病毒DNA含量来测定其病毒含量,只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转导试剂能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转导效率,包括传统转染方法转导效率低的非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

ViraSafe™ 慢病毒表达系统——Cell BioLabs慢病毒表达载体

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合持久表达、免疫反应小等优点。市场上的慢病毒是由人类免疫缺陷病毒(HIV),通过去除env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装,从而更安全,宿主范围更广,还能增加病毒的滴度。

慢病毒载体的发展经历了3个阶段:第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转绿和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离,分别构建在三个独立的质粒表达系统上,即包装质粒(一个强启动子如CMV作用下,控制除env以外所有病毒结构基因的表达)、包膜质粒(包含VSV-G基因)和载体质粒(包含目的基因),用这三种质粒共同转染包装细胞如人胚肾293T细胞,在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第二代慢病毒载体系统从安全性角度又删去了HIV的所有附属基因。第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进,如删除了U3区的3′LTR和tat基因。

ViraSafe™ 慢病毒表达系统——Cell BioLabs慢病毒表达载体

安全性始终是大家关心的问题,毕竟是HIV改造过来的,不容许有一点闪失。国内的实验室很多都达不到P2的级别,甚至是一堆人挤在一个房间里做各种各样的实验。Cell BioLabs的新一代慢病毒表达系统对广泛应用的第三代慢病毒进行了改进,将Rev与gag和pol基因分离,这意味着要产生原始的病毒,还需要更多的重组步骤。这样完整的ViraSafe™ 慢病毒表达系统包含5个载体(包括一个对照载体),安全性更高。

慢病毒的表达流程一般如下:将目的基因片段克隆到表达载体上;将重组表达载体,与包装混合物(通常是几个质粒的混合物)共转染293细胞;收集病毒上清,测定滴度;感染目的细胞,瞬时表达目的蛋白或用抗生素筛选稳定细胞株;分析目的蛋白。看上去并不复杂,但中间许多步骤需要不断优化。而且慢病毒有一个软肋,就是病毒滴度不高。你可能还需要纯化或浓缩,才能得到108TU/ml的慢病毒。

与目前市场上流行的新一代慢病毒相比,ViraSafe™ 慢病毒表达系统进行了进一步的优化。如在载体质粒上插入了cPPT(增加基因表达水平)及WPRE(增加感染滴度),在一个包装载体中插入腺病毒VA基因以增加感染滴度;同时在整个系统载体的多个部分做了一些基因的优化或删减和插入以增加病毒的安全性。经过这样的优化,ViraSafe™ 最新一代慢病毒表达系统的包装容量增大到10kb,在应用上更广泛;其感染细胞的滴度及外源基因的表达水平均提高,这也在一定程度上弥补了慢病毒在基因治疗领域内的不足;由于对整个慢病毒系统的多层面改造,降低了载体间的同源率和重组机率,更安全。如果您的实验需要长期稳定的基因表达或沉默,而目的细胞又很难转染,那ViraSafe™ 慢病毒表达系统将是您的最理想选择。

产品名称 货号 产品说明
ViraSafe™ Universal Lentiviral Expression System VPK-211-ECO 通用慢病毒表达系统,MCS位点前无启动子,克隆时可插入特异性启动子序列,分双嗜和多嗜两种
VPK-211-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Puro) VPK-212-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Puro抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-212-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Neo) VPK-213-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Neo抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-213-PAN
ViraSafe™ Lentivirus Expression System (Hygro) VPK-214-ECO EF-1α真核细胞启动子类型,带有Hygro抗性筛选标记,分双嗜和多嗜两种
VPK-214-PAN

另外,根据您实验的不同需求,ViraSafe™ 设计出不同的启动子类型供您选择。有不含有启动子的通用型慢病毒表达载体,您可以用来表达特异性启动子引导的基因;还有真核基因强力启动子CMV启动子类型以及用于表达shRNA的RNAi以及miRNA的启动子供您选择。

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe™ 慢病毒表达系统有多种样式供您选择;专门针对慢病毒滴度低的软肋而专门设计的ViraBind™慢病毒浓缩&纯化试剂盒,能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒;还有多种慢病毒快速定量以及感染滴度滴定检测方案;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中,由于加入了GFP标记蛋白,因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便,且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解,然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下慢病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液,定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据。检测灵敏,可以从100ul慢病毒上清中检测出1010VP/ml的慢病毒,足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit VPK-112 荧光法检测,20次分析

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择;多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案;ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒,解决了慢病毒低滴度的软肋;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺病毒定量——Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒

通过对腺病毒基因组的改造,腺病毒载体是继逆转录病毒载体后被广泛应用的转基因载体,现已发展到第三代,转染效率高,且相对制备容易。从最早的腺病毒载体出现至今,腺病毒载体的包装系统已经经历了一系列的改进。腺病毒载体已经被广泛应用于动物细胞的基因转染和基因治疗等。

在腺病毒的应用过程中,我们经常需要测量病毒液的病毒含量以及腺病毒滴度。目前实验里做腺病毒常规滴度检腺病毒定量——Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒测有通过TCID50或者空斑计数法(PFU)测量腺病毒感染滴度的方法,但是这种传统的方法实验周期较长,操作繁琐。如常规PFU的检测就就需要10天左右的时间。Cell BioLabs的QuickTiter™腺病毒功能滴定试剂盒,采用免疫蛋白反应的原理检测腺病毒标志性外壳蛋白——Hexon的表达含量,从而得到腺病毒液的功能滴度,只需2天多的时间就能获得比常规实验所需要10天的测量结果还要准确的数据。但是即使是这样的方法,也需耗时2天,一般说来,如果已经获得了纯化的病毒液,通过测量OD260来估算病毒颗粒的总含量不失为一种快捷的多的腺病毒定量方案。

上海金畔生物科技有限公司针对腺病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Adenovirus Rapid Quantitation Kit(目录号:VPK-106)。该试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核算分子降解,然后用特异性的腺病毒捕获珠子结合腺病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下腺病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照腺病毒DNA标准曲线得出腺病毒滴度。

Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、腺病毒捕获液、Dye染料以及腺病毒DNA标准物。该试剂盒不仅能直接用于已纯化的病毒悬液,对于未纯化的腺病毒,该试剂提供快速纯化试剂,您可以在纯化前通过该kit测算出病毒悬液上清中的腺病毒含量,也可以使用该Kit内的纯化试剂先进行纯化步骤。整个腺病毒定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据,检测灵敏。

另外,该定量试剂盒不仅能应用于腺病毒,由于是通过OD260测量核酸含量从而通过与标准曲线的比对得出腺病毒的含量,因此还能应用于其他的病毒定量。如反转录病毒,慢病毒等。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Adenovirus Quantitation Kit VPK-106 荧光检测,20次测定

Cell BioLabs为您提供全套的腺病毒技术解决方案,RAPAD®腺病毒表达系统有多种样式供您选择,还有预装有多种重组基因的腺病毒供您直接使用,ViraBind™腺病毒小提及中提大提试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的腺病毒,Cell BioLabs还有转为腺病毒载体用的293AD细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对腺病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

RAPAd®腺病毒表达系统——Cell BioLabs重组腺病毒载体

基因免疫和治疗是将外源目的基因转移到机体内,表达具有生物学功能的蛋白,达到免疫预防或治疗的目的。病毒载体是常用的基因导入方式之一。腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)、反转录病毒载体、腺病毒伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和牛乳头瘤病毒载体等是基因免疫和治疗研究中应用较多的载体。目RAPAd®腺病毒表达系统——Cell BioLabs重组腺病毒载体前,基因治疗临床试验的40%都采用腺病毒载体。

重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力。同时作为作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。腺病毒可感染分裂细胞和非分裂细胞,转导细胞种类多,如肺细胞、肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。其感染细胞滴度和外源基因的表达水平较高,因此重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达。当腺病毒进入细胞后,病毒不与染色体发生重组重排,因此不会导致宿主细胞基因的激活和失活。最近,重组腺病毒也被应用于递送RNAi到细胞内。

目前比较成熟的制备重组腺病毒的方法主要有两种,第一种是在腺病毒包装细胞系里,通过包含有目的基因的穿梭载体和含有腺病毒骨架质粒载体(E1/E3功能限制型)之间的同源重组重组,然后使用多蚀斑分离方法分离出目的重组腺病毒,这种方法耗时耗力,一般需要12-18周的时间。第二种是使用pAdEasy系统,通过在大肠杆菌E.coli中的双同源重组功能,同源重组目的基因的穿梭载体和把含有腺病毒骨架质粒载体从而得到重组腺病毒,该方案具有很高的保真性,但是由于需要筛选大量的细胞克隆,虽然比第一种方法省略了一些操作步骤,但是也是较为费时的,整个程序约需要8-9周。

针对以上腺病毒表达系统的不足,Cell Biolabs的RAPAd®腺病毒表达系统提供了一个更快更安全的产生无RCA,且高滴度的重组腺病毒方案。该系统使用了全新的腺病毒骨架基因(缺失左侧ITR、包装信号和E1序列),无需进行pAdEasy的细菌体内的同源重组步骤,无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤,因此不管是操作上还是时间上都进行了很大的提升。该腺病毒表达系统较其他系统生长更快,只需要2周时间;并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险,无E1a,不产生复制型腺病毒。

RAPAd®腺病毒表达系统——Cell BioLabs重组腺病毒载体
通过RAPAd®腺病毒表达系统产生的重组腺病毒。PacI线性化的pacAd5 RSV-GFP载体和pacAd5 9.2-100载体共转染293细胞后,用倒置荧光显微镜观察到转染后病毒颗粒的位置。 

Cell Biolabs的RAPAd®腺病毒表达系统更易实验室人员的使用,操作方法简捷,很容易上手,并且由于对腺病毒骨架载体和穿梭载体都进行了优化,在共转染直到从病毒颗粒中分离过程中都大大简化,同时保证了高效的感染滴度。另外,在Cell Biolabs的RAPAd®腺病毒表达系统中,具有三种启动子模式供您选择。有不含有启动子的,您可以用来表达特异性启动子引导的基因,还有真核基因表达启动子RSV和强力启动子CMV供您选择。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
RAPAd® Universal Adenoviral Expression System VPK-250 通用型腺病毒表达系统
RAPAd® RSV Adenoviral Expression System VPK-251 RSV启动子型腺病毒表达系统
RAPAd® CMV Adenoviral Expression System VPK-252 CMV启动子型腺病毒表达系统

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供全套的腺病毒技术解决方案,RAPAD®腺病毒表达系统有多种样式供您选择,还有预装有多种重组基因的腺病毒供您直接使用,ViraBind™腺病毒小提及中提大提试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的腺病毒,Cell BioLabs还有转为腺病毒载体用的293AD细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对腺病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。