第六回 小胶质细胞-星形胶质细胞相互关联控制脑卒中

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

山梨大学大学院　综合研究部　医学域　药理学讲座　小泉修一

◆前言

如今，胶质细胞在大脑功能中发挥的作用被不断地阐明。尤其是在各种大脑疾病中，胶质细胞的变化迅速、大且多样，因此研究人员认为这些胶质细胞的变化在大脑的异常和修复过程中可能发挥了重要的作用。这些假设逐渐被认可的同时，仍残留了许多课题。例如，胶质细胞研究在体外和体内实验的研究结果差异大，目前在体外实验获得的研究结果无法直接运用至体内实验研究。

此外，至今为止的大部分研究，都将各类胶质细胞分为小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等分别进行研究，忽略了大脑功能受异源胶质细胞间交流结果的控制。当然，胶质细胞研究的历史和经验尚浅，先阐明各类胶质细胞的性质十分重要，而近期的研究以各类形式提出，胶质细胞可能作为集结者，通过异源胶质细胞间的协作控制大脑功能。

本文着眼于体内脑卒中模型中小胶质细胞-星形胶质细胞的关联，阐述其交流在控制大脑功能时发挥作用的重要性。

◆小胶质细胞-星形胶质细胞的关联

小胶质细胞对大脑内外环境的变化非常敏感，能够感知细微的变化，并先于大脑做出变化。例如，小胶质细胞在中年期就已活化并开始衰老^1），而在肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病中，它们在发病前就已活化并与疾病的发病机制和难以治疗相关^2）。虽然活化的小胶质细胞可以直接控制神经细胞的功能，但通过作用于星形胶质细胞能影响大脑功能。在外伤性脑损伤模型中，小胶质细胞首先感知到损伤并传达给星形胶质细胞，从而发挥保护作用^3），另外感知到炎症的小胶质细胞通过传达信息给星形胶质细胞来控制神经细胞的功能^4）。

若先经历过非侵袭性缺血应激，在后来的侵袭性缺血时便可获得抗性，这种现象称为“缺血耐受性”，在实验和临床上比较常见（图A，B）。在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠中，首先发生强烈变化的细胞是小胶质细胞，其次是星形胶质细胞^5）。即使是不会造成显著伤害的非侵袭性MCAO（预处理，PC），灵敏的小胶质细胞仍会活化。

另外，非侵袭性MCAO以外的PC也能够诱导缺血耐受性，出现交叉缺血耐受性现象，但诱导交叉缺血耐受性的典型代表PC是革兰氏阴性细菌细胞壁成分的lipopolysaccharide（LPS，脂多糖）。LPS在中枢对小胶质细胞Toll样受体4的作用特别强，表明小胶质细胞对于缺血耐受性诱导来说至关重要。

这些小胶质细胞性缺血耐受性的诱导机制与Ⅰ型干扰素介导的通路密切相关，其他小胶质细胞依赖性神经胶质递质、细胞因子、神经营养因子等也非常重要。因此，小胶质细胞不仅能够直接作用于神经细胞，还通过作用于星形胶质细胞等其他类型的胶质细胞，间接诱导缺血耐受性的机制，近年有人提出了后者的重要性。

图. 通过胶质细胞交流获得缺血耐受性的机制

A. 侵袭性脑缺血导致的神经细胞严重损伤或死亡。

B. 经历非侵袭性缺血（PC）后，诱导其在侵袭性缺血时获得抗性的缺血耐受性。

C. PC类的轻度刺激由小胶质细胞先感知。小胶质细胞转化为活性小胶质细胞，直接参与缺血耐受性诱导，同时诱导星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。反应性星形胶质细胞通过多种机制促进缺血耐受性的形成，特别是通过P2X7受体表达和P2X7受体依赖性HIF1α表达介导的神经保护机制，缺血耐受性持久且强效。

◆从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号传递

感知到PC后的小胶质细胞如何把信号传达给星形胶质细胞呢？一般有多种DAMP，而ATP作为最初的信号尤为重要。ATP/P2受体信号的显著变化是脑卒中初期及LPS负荷小胶质细胞最初的应答变化。

感知到LPS后的小胶质细胞通过表达囊泡核苷酸转运蛋白（Vesicular nucleotide transporter），增强ATP的胞吐作用^6）。感知到脑卒中后的小胶质细胞会表达一般情况下不表达的P2Y1受体，并结合ATP，使小胶质细胞自身的功能发生巨大变化^7）。尤其是ATP，即使在脑卒中以外，在受到高度的兴奋性刺激时^4）,在外伤性脑损伤^3）等的初期应答中，作为从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号起着核心作用。小胶质细胞自身也有保护大脑的作用^7），第一时间感知到更敏感的小胶质细胞信息，并将该信息传达给大脑保护功能更强大的星形胶质细胞，通过这种级联反应，发挥作为各脑部疾病安全装置的作用。

◆作为缺血耐受性执行细胞的星形胶质细胞

PC可使星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。抑制该功能就会使缺血耐受性消失，因此可以说反应性星形胶质细胞是诱导缺血耐受性的必要条件。反应性星形胶质细胞是缺血耐受性诱导的执行细胞，其自身直接或通过与神经细胞和其他细胞的交流间接地在缺血耐受性诱导中发挥核心作用。

例如，反应性星形胶质细胞具有产生神经保护分子、增强兴奋性神经递质和去除有毒物质的功能、调节能量代谢等多种作用，特别是通过P2X7受体介导的作用更强^5，8，9）。通过PC，反应性星形胶质细胞通过星形胶质细胞特异性大量（100倍以上）且长期（8周以上）地使P2X7受体的表达增强，并以受体依赖性诱导缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor1α，HIF1α），发挥强烈的缺血抵抗性（图C）。

包括这种星形胶质细胞特异性的P2X7受体表达增强机制在内，缺血耐受性型星形胶质细胞的诱导机制还有很多尚不明确的地方。如上所述，由于小胶质细胞在PC诱导反应性星形胶质细胞之前活化，因此认为是小胶质细胞诱导了缺血耐受性型星形胶质细胞。然而这种推测是否正确，有关小胶质细胞诱导的星形胶质细胞表型多样性等相关问题，仍有许多不明之处，有待今后进一步研究。

此外，小胶质细胞如何感知非侵袭性的温和PC？又会产生怎样的表现型？小胶质细胞向星形胶质细胞和神经细胞传达的信号分别又是什么？等等一系列的问题尚待解决。但是，小胶质细胞-星形胶质细胞如同继电器一样传达大脑环境内的变化，并以此改变其在大脑中的应答性机制，被认为是各种脑部疾病发病前的常见现象。揭示了这是一种溢出效应较大的现象，期待未来的研究进展。

◆结语

本文以缺血耐受性为例，表明了小胶质细胞在控制神经胶质细胞脑功能方面的重要性。虽然小胶质细胞和星形胶质细胞均具有诱导缺血耐受性的潜力，但事实上小胶质细胞-星形胶质细胞关联的相互作用很可能发挥更重要的作用。随着各类胶质细胞的研究日渐活跃，预计未来异源细胞间相互作用控制神经细胞的观点也会越来越重要。

◆参考文献

1）Zhang, G. et al. : Nature, 497, 211 (2013). DOI: 10.1038/nature12143

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3）Shinozaki, Y. et al. : Cell Rep., 19, 1151 (2017). DOI: 10.1016/j.celrep.2017.04.047

4）Pascual, O. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E197 (2012). DOI: 10.1073/pnas.1111098109

5）Hirayama, Y. et al. : J. Neurosci., 35, 3794 (2015). DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4218-14.2015

6）Imura, Y. et al. : Glia, 61, 1320 (2013). DOI: 10.1002/glia.22517

7）Fukumoto, Y. et al. : J. Cereb. Blood Flow Metab., 39, 2144 (2019). doi: 10.1177/0271678X18805317

8）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Glia, 65, 523 (2017). DOI: 10.1002/glia.23109

9）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Neurosci. Res., 126, 53 (2018). DOI: 10.1016/j.neures.2017.11.013

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第5回 使用人血预测大脑内小胶质细胞的活动性进行心理逆转录研究

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

九州大学大学院 医学研究院 精神病医学 加藤隆弘

◆前言

近年有研究提出，在神经退行性疾病以及各种神经精神疾病中，免疫细胞小胶质细胞的参与对脑内炎症起着重要的作用，然而目前的发现还只是冰山一角。过去以小胶质细胞为目标的临床研究，其重点集中在死后的大脑研究和正电子发射型计算机断层显像（PET）研究。在这些研究中，主要报告了精神分裂症、抑郁症、自闭症谱系障碍和自杀患者大脑内小胶质细胞的过度活化。虽然利用PET技术可以对活体患者大脑内的部分小胶质细胞的活化进行测量，但实际上小胶质细胞活化的形式多样，而目前的PET技术能够检测到的活化种类只有TSPO这类占少数的活化形式。此外，关于分辨率也存在问题，仅使用PET，尤其是在分子水平上，评估动态且多样的小胶质细胞活化是非常困难的。特别是在新药开发方面，阐明分子基础是研究的关键，其局限性不容忽视。

理想的情况应当是采集并分析患者大脑中的小胶质细胞，但在伦理和技术层面上的难度太高。因此，分析从啮齿类等模型动物的大脑中采集的新鲜小胶质细胞，对于阐明小胶质细胞的病理而言必不可少，笔者的实验室也正在推进以小胶质细胞为重点的小鼠模型实验^1）。然而，想要制备能够满足所有精神疾病表现型的模型动物是不可能的。为了打破这些局限，我们将在本文中介绍正在推进以人为对象，使用易于采集的血液进行精神疾病的逆转录研究内容。

◆人血来源iMG细胞的开发及应用

2016年以来，关于人iPS细胞来源小胶质样细胞开发的案例屡见报道，对于阐明小胶质细胞在各种脑疾病中的病理机制的期待也越来越高^2,3）。尤其是在对遗传影响大的疾病中，分析iPS细胞来源小胶质样细胞十分有用，但在精神疾病中，相比遗传因子，更多的是环境因子造成的疾病，所以分析能够反映状况的疾病模型细胞显得非常重要。而笔者的实验室也一直在研发一种不使用重编程的iPS细胞，直接从体细胞中诱导小胶质样细胞的技术。

2014 年，通过向人外周血单核细胞添加GM-CSF和IL-34两种细胞因子，成功制备出只需两周即可完成的直接诱导小胶质（iMG）细胞（图 1）^4）。

图1. 人血液来源直接诱导小胶质样（iMG）细胞的特征（转载改编自文献4和5）

与iPS细胞不同，iMG细胞无需一切基因重组的操作，只需通过化学诱导即可在短时间内制备获得，并能以相对较低的成本制备出大量的样品。此外，iMG细胞可以检测吞噬作用和细胞因子生成能力等动态功能，并且可以分析活细胞的各种分子水平，有望弥补死后大脑研究和PET研究的不足^4,5）。

在2014 年开发时，发现iMG细胞具有人脑小胶质细胞的许多特性，并显示与单核细胞和巨噬细胞不同的表现型^4）。美国马萨诸塞州综合医院（MGH）的研究小组根据笔者团队的建议，通过微阵列分析发现所制备的iMG细胞与人脑小胶质细胞最为相似^6）。笔者团队通过和九州大学脑外科合作，使用RNAseq进行全面的基因表达分析，发现了外周血来源的iMG细胞与同一患者相同时期的大脑小胶质细胞类似（Tanaka, S. et al. : Frot. Immunol., in press）。

人iMG细胞已经应用于神经精神疾病和疼痛性疾病的病理阐明研究和生物标记开发研究。笔者团队首先着眼于代表性的原发性小胶质细胞疾病Nasu-Hakola病（NHD）。从一名30多岁时出现精神症状、40多岁时痴呆症状恶化并处于长期卧床状态的女性患者中制备的iMG细胞中发现，对于吞噬刺激，TNF-α和IL-6等炎症细胞因子的生成的应答具有延迟倾向，同时还发现了IL-10等保护性细胞因子的生成往往从早期阶段开始就被抑制^4）。这些患者来源iMG细胞的反应，表明了由小胶质细胞引起的慢性脑内炎症参与了Nasu-Hakola病等多种精神症状的出现和青年性痴呆的发病^4）。

接着，当笔者在进行临床相关的双相情感障碍I型和快速循环型（Rapid cycler）患者的iMG细胞分析时，发现1名男性患者在躁狂状态下显示的mRNA分析为M1型显性；与佐贺大学精神科合作，并尝试对3名患者进行分析时，发现作为M2型代表性标记的甘露糖受体CD206，其mRNA表达处于“抑郁状态”时，同时表现亢进^7）。这些结果表明，小胶质细胞免疫应答的变化可能在双相情感障碍的“躁狂”和“抑郁”的转变过程中起重要作用^7）。

此外，我们还与九州大学心理科合作，使用不单是精神疾病患者，更针对身体疾病患者的iMG细胞进行了逆转录研究^5），在女性纤维肌痛患者的iMG细胞中，发现了TNF-α mRNA的高表达，我们提出其可能会成为疼痛性疾病的客观性生物标记^8）。在与九州大学脑外科合作时，我们还发现iMG细胞CD206的表达模式可能是可以预测脑肿瘤（神经胶质瘤）进展的标记（Tanaka, S. et al. : Front. Immunol., in press）。

iMG细胞已经在国外的研究机构中得到灵活应用。上述的MGH团队通过对精神分裂症患者血液来源的iMG细胞和同一患者iPS细胞来源的神经元进行共培养实验，发现在精神分裂症患者中，活化的小胶质细胞对补体介导的神经突触损伤非常重要，据报道称，通过使用对小胶质细胞活化具有抑制作用的抗菌剂米诺环素，可以挽救神经突触损伤^9）。美国和荷兰等国际合作研究团队也开始使用精神分裂症患者来源的iMG细胞进行研究，据报道称，患者来源的iMG细胞对LPS反应更为灵敏，可产生更多的TNF-α^10）。

◆人血代谢组学分析

在笔者的实验室中，不仅研究血细胞成分，还从血浆和血清中寻找线索，以了解大脑中小胶质细胞的动态。例如，在使用血浆进行神经来源外泌体相关的分析中，发现小胶质细胞活性所必需的细胞因子IL-34可能与抑郁症的病理相关^11）。另外，在与九州大学检查部合作期间，从呈现抑郁的患者中采集外周血进行代谢组学分析时，发现了部分与抑郁症严重程度相关的血液代谢物，并且还发现了自杀意愿的强烈程度与小胶质细胞活化密切相关的色氨酸-犬尿氨酸代谢途径中的多种代谢物相关^12,13）。

这些结果支撑了死后大脑研究中自杀患者大脑内小胶质细胞活化的报告内容。假设的控制和掌握小胶质细胞的活化有助于应对自杀这一紧迫的社会问题，我们目前正在结合各种方法来推进双方向性研究^14）（图2）。

图2. 阐明精神疾病的病理和开发生物标记的多轴方法

（例：自杀相关行为的对策），参考文献14的引用·改编

◆结语

小胶质细胞的过度活化和活化控制不足可能与抑郁、不安、妄想以及产生自杀念头等精神症状或精神病理相关。今后，我们将继续以各种精神疾病为对象获取临床数据，进行人体血液分析（iMG细胞分析和代谢组学分析）以及推进结合人脑分析的逆转录研究，通过阐明分子细胞水平上小胶质细胞介导的精神病理学机制，有望开发出以小胶质细胞为靶向的新型治疗药。通过采血制备iMG细胞的分析和代谢组学分析，有望用作能够反映不止在精神疾病上，更能对在各种疾病中大脑小胶质细胞动态的客观性生物标记。

本系列在九州大学大学院药学研究院 药理学领域 津田 诚 老师的协助下策划并撰写。

◆参考文献

 1. Ohgidani, M. et al. : Brain Behav. Immun., 55, 17-24 （2016）.

 2. Muffat, J. et al. : Nat. Med., 22, 1358-1367 （2016）.

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14. Suzuki, H. et al. : Front. Cell. Neurosci., 13, 31 （2019）.

◆小胶质细胞研究用Iba1抗体系列

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第4回 小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死后炎症和修复的控制机制

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

东京都医学综合研究所 脑中风再生项目 庆应义塾大学药学系生化学讲座 大谷健人

东京都医学综合研究所 脑中风再生项目 日本医疗研究开发机构 七田崇

◆前言

在日本，脑梗死约占脑中风的80％，是造成植物人状态和死亡的的主要原因。脑梗死，是由于大脑血流量的减少使得向脑组织供应的氧气和营养物质不足，从而导致脑组织缺血性坏死（梗塞）。脑缺血会引起各种各样的细胞应激，炎症就是其中的应激反应之一。在脑缺血后的炎症中，常驻于脑组织中的巨噬细胞即小胶质细胞和伴随血脑屏障的破坏浸润脑组织的巨噬细胞会产生炎性细胞因子。

小胶质细胞和巨噬细胞对脑梗死后的炎症作用会持续数日，之后便不会再产生炎性细胞因子。但是，为了促进脑组织的修复，小胶质细胞和巨噬细胞的作用会发生改变。最近，关于小胶质细胞和巨噬细胞作为炎性细胞和修复细胞起作用的分子机制屡见报道。本文在讨论脑梗死后的炎症和通过巨噬细胞进行神经修复的分子机制的同时，还阐述了以小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中的功能为靶点的治疗药物的开发前景。

◆在脑梗死后的炎症中小胶质细胞和巨噬细胞的作用

由于血脑屏障的破坏，在血液中循环的巨噬细胞会浸润脑组织。众所周知，巨噬细胞浸润大脑内少不了趋化因子，尤其是CCL2（C-C motif chemokine 2）与它的受体CCR2（C-C chemokine receptor 2）在巨噬细胞浸润脑组织时起着重要的作用^1）。CCL2由缺血性脑组织中的细胞产生。研究发现，若缺损CCL2，巨噬细胞对脑组织内的浸润就会减弱，如果在抑制脑梗死病发后的早期抑制巨噬细胞浸润的话，可以减轻大脑内的炎症，达到保护大脑的效果^2）。因此，我们认为CCL2-CCR2的相互作用对于炎性巨噬细胞的大脑内浸润非常重要。

如果由于缺血引起组织坏死的话，组成组织的物质就会被释放，而这些被释放的物质中含有会引起炎症的分子，被称为DAMPs（Damage-associated molecular patterns）^3）。DAMPs会激活在小胶质细胞和巨噬细胞中表达的模式识别受体（Pattern recognition receptors : PRRs），从而引起脑梗死后的炎症（图1）。脑梗死后的主要DAMPs有HMGB1（High mobility group box1）和PRX（Peroxiredoxin）。

图1. 脑梗死后引起的炎症

从缺血性坏死的脑细胞中释放出HMGB1、PRX等DAMPs。HMGB1破坏血脑屏障，使得血液中的巨噬细胞浸润脑组织。DAMPs通过TLRs等模式识别受体激活小胶质细胞和巨噬细胞，诱导炎性细胞因子的产生，从而引起脑梗死后的脑水肿和进一步的神经损伤。

HMGB1 作为存在于细胞核内的DNA结合蛋白被发现。在脑组织中主要是神经细胞产生HMGB1，在脑缺血2~4 h后，可观察到HMGB1被释放至神经细胞外的状态^4，5）。HMGB1使脑组织中MMP9（Matrix metalloproteinase 9）的表达升高，促进了血脑屏障的破坏从而导致炎症加重^6）。而且HMGB1会激活中性粒细胞，诱导被称为NETs （Neutrophil extracellular traps）即中性粒细胞胞外诱捕网的释放^7）。中性粒细胞胞外诱捕网是由基因组DNA和弹性蛋白酶、髓过氧化物酶等杀菌酶组成的复合物，被认为在感染和炎性疾病中具有排除病原体和加重组织中炎症的作用，由中性粒细胞和巨噬细胞释放^8）。在脑梗死组织中也可以观察到NETs，被认为会加重脑梗死后的炎症和神经损伤。另外，在脑梗死后的血管中也可观察到NETs，在血管内释放NETs可能会促进血栓的形成，减少梗塞部位周围的脑血流量，加速神经症状的恶化。

PRX是细胞内将过氧化氢代谢成水的抗氧化蛋白。PRX在缺血后脑细胞中的表达升高，对氧化应激具有细胞保护的功能^9）。另外，在细胞内积存的PRX被缺血性坏死的细胞释放至细胞外，激活小胶质细胞和浸润脑组织的巨噬细胞的模式识别受体，从而诱导炎性细胞因子的产生。

Myd88是在Toll样受体（Toll-like receptors : TLRs）的信号下游发挥作用的衔接分子，TLRs为主要的模式识别受体，在缺乏Myd88的小鼠中几乎丧失了TLRs的功能。用缺乏Myd88的小鼠制备脑梗死模型，发现浸润大脑的免疫细胞中的炎性细胞因子明显减少^10）。众所周知，TLRs原本是通过识别细菌和病毒等病原体来源的分子来激活免疫细胞的，但它也能识别受损组织所释放的自身来源分子，引起无菌性炎症。

对于脑梗死，释放至细胞外的PRX会激活TLRs，诱导IL-1β （Interleukin-1β）、IL-23和TNF-α（Tumor necrosis factor α）等炎性细胞因子的产生。在啮齿类的脑梗死模型和脑中风患者中，研究人员认为这些炎性细胞因子会加重缺血后的炎症，引起脑水肿，并与神经损伤和预后不良相关^11）。

◆脑梗死后巨噬细胞的炎症收敛作用

小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死后的炎症中起重要作用，但炎性细胞因子的产生只在脑梗死发病的几天后达到峰值，之后就会不断减少^12）。在脑梗死发病后的几天至一周左右，巨噬细胞会促进炎症收敛作用，并为了有助于神经修复而发生功能变化^13）。这些巨噬细胞会产生抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β（Transforming growth factor β），具有神经保护作用。

在脑组织中，用腺病毒使IL-10过度表达，可以防止脑梗死后的神经细胞死亡和梗死体积扩大^14）。TGF-β是具有炎症抑制作用的控制性T细胞分化的重要因子，可以减轻脑梗死后的炎症^15）。如上所述，巨噬细胞在脑梗死中会产生炎症抑制性的因子。

从脑组织内排出DAMPs对于脑梗死后的炎症收敛非常重要。在小胶质细胞和巨噬细胞中表达的清道夫受体（MSR1或MARCO）可以识别PRX、HMGB1 等DAMPs，并将DAMPs从脑梗死组织中排出。在缺乏MSR1或MARCO的小鼠中，通过延迟DAMPs从脑梗死组织中排出，来延长炎症状态，可以发现其神经系统症状与野生型的小鼠相比更为严重^16）。

MSR1在小胶质细胞和巨噬细胞中的表达，从脑梗死发病后的第1天到第3天会升高，像这样的MSR1表达升高，巨噬细胞分化的重要转录因子Mafb起了重要作用。在MSR1表达高的巨噬细胞中，比起TNF-α、IL-1β、IL-23等炎性细胞因子，主要还是产生像IGF-1（Insulin-like growth factor1）这样的神经营养因子^16）。向脑梗死的大鼠给药苯酞衍生物，升高MSR1在浸润脑组织的巨噬细胞中的表达，促进DAMPs的排出。结果显示，TNF-α的产生减少了^17）。因此，脑梗死后DAMPs的排出是使炎症收敛的重要过程。

脑梗死发病后经过7天左右，小胶质细胞和巨噬细胞会通过炎症收敛来促进修复，帮助脑梗死后的恢复^18）。有报告称，巨噬细胞中缺乏CCR2的小鼠，脑梗死发病的几天后炎症会有所减弱，但发病5天后炎症会反弹，使神经症状加重，导致脑梗死后的恢复不佳^13，19）。

脑梗死发病7天后，从小胶质细胞和巨噬细胞中产生IGF-1、FGF-2等有大脑保护作用的营养因子^20，21）。由于这些营养因子参与髓鞘再生和突触形成，被认为对脑梗死后的恢复具有重要作用^22）。像这样，浸润脑梗死组织的巨噬细胞被认为是通过从炎症性到炎症收敛和修复性的性质变化，来帮助脑梗死后的功能恢复。

◆以小胶质细胞和巨噬细胞为治疗靶点的脑梗死后的炎症控制

在脑梗死的急性治疗中，通过静脉内注射rt-PA（Recombinant tissue plasminogen activator）进行血栓溶解和血栓清除术^23）。尚未验证免疫抑制剂类固醇、环孢菌素和他克莫司等对脑梗死患者功能预后的改善效果。因此，开发出既可以抑制脑梗死后的炎症又可以加速炎症收敛并促进修复的药物备受期待。

以IL-10 和TGF-β为治疗靶点的药物，除了难以诱导仅抗炎性细胞因子的表达外，在脑梗死中进行表达控制的合适时期还尚不明确。向脑梗死小鼠给药DHA（Docosahexaenoic acid）、IL-13和甲异靛（Meisoindigo），使小胶质细胞和巨噬细胞的性质改变为抗炎性和修复性^24-26）。给药血管生成素后，炎性细胞因子的产生减少，观察到促进血管新生和保护大脑的效果^27）。近期的报告显示，像PPARγ和STAT6 这样的转录因子可能是使脑梗死后炎症收敛的治疗靶点分子^28）。

如果可以阐明使小胶质细胞和巨噬细胞的炎症收敛和修复作用持续进行的分子机制，将有可能开发出改善包含脑梗死等各种器官损伤的预后治疗药物。另外，虽然很少有可以在脑梗死发病24 h后才开始使用的治疗药物，但开发出在发病几天后才给药也能改善脑梗死后功能预后的治疗药物的可能性很高。

◆结语

小胶质细胞和巨噬细胞具有炎性、抗炎性、炎症收敛性和修复性等多种功能，在脑梗死后的不同时期对病情的发展起着重要的作用（图2）。可促进和维持小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中炎症收敛和修复作用的新一代治疗药物的开发，正备受期待。

图2. 小胶质细胞和巨噬细胞在脑梗死中的多种功能和作用

脑梗死发病后，从缺血性坏死的脑细胞中释放的DAMPs，会激活小胶质细胞和巨噬细胞，从而产生IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子。另外， MSR1表达高的小胶质细胞和巨噬细胞会从脑梗死组织中排出DAMPs，通过产生具有神经修复功能的IGF达到保护大脑的效果。

缩略语

CCL2：C-C motif chemokine 2；

CCR2：C-C chemokine receptor 2；

DAMPs：Damageassociated molecular patterns；

PRRs：Pattern recognition receptors；

HMGB1：High mobility group box1；

PRX：Peroxiredoxin；

MMP9：Matrix metalloproteinase 9；

NETs：Neutrophil extracellular traps；

TLRs：Toll-like receptors；

IL-1β：Interleukin-1β; 

TNF：Tumor necrosis factor；

TGF-β：Transforming growth factor β；

IGF-1：Insulin-like growth factor1；

rt-PA：Recombinant tissue plasminogen activator；

DHA：Docosahexaenoic acid

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

◆参考文献

 1. Mildner, A. et al. : Nat. Neurosci., 10, 1544 (2007).

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 3. Huang, J. et al. : Ageing Res. Rev., 24, 3 (2015).

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◆小胶质细胞研究用Iba1抗体系列

◆神经炎症相关抗体

※以上所有产品仅供实验研究用，不可用于人体，不可用作医药品、食品、临床诊断等。

第3回 探索大脑吞噬细胞的奥秘

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

东京大学 大学院药学系研究科 药品作用学教室

河野 玲奈、池谷 裕二、小山 隆太

◆前言

吞噬作用是免疫系统中的重要过程。不仅是从体外入侵的病毒和病原菌，体内产生的死细胞、异常凝集蛋白等所有废弃物，皆为吞噬 “专业”的吞噬细胞的作用对象。

在大脑中有时也被称为组织驻留巨噬细胞（请注意该名称具有争议性）的小胶质细胞，被认为是主要的免疫细胞和吞噬细胞，围绕其吞噬能力已有大量的研究。但是近年来的研究显示，不仅是小胶质细胞，星形胶质细胞也具有吞噬能力^1）。

星形胶质细胞是胶质细胞的一种，具有摄取神经递质、给神经细胞提供包括营养因子在内的物质、以及形成血脑屏障等多种功能，而与这些功能并存的吞噬作用，与小胶质细胞的吞噬作用在各个方面都具有不同的特征。因此，本文在比较星形胶质细胞和小胶质细胞各自的吞噬特点与作用的同时，对大脑中的吞噬作用进行了探究。

◆凋亡细胞的吞噬

Damisah等人比较了星形胶质细胞和小胶质细胞对单个凋亡细胞的吞噬作用的差异^2）。其通过使用荧光染料和激光照射单细胞水平的凋亡诱导技术来诱导一个神经细胞死亡，并用双光子成像在体内观察周围小胶质细胞的应答。其结果显示，小胶质细胞吞噬了细胞体及细胞体附近的树突，而星形胶质细胞则吞噬了远处的细小突起。基于这个结果，Damisah等人提出了凋亡细胞在细胞体周围和远处的突起发出的“eat me”信号可能是不同的。另外，也有报告称在经药理性去除小胶质细胞的小鼠大脑中，星形胶质细胞会代替其完成吞噬、去除细胞体的任务，但存在时间上的差异，小胶质细胞的去除在诱导凋亡后约20小时后执行，而星形胶质细胞的去除在诱导凋亡后约50小时后执行。

Lööv等人使用培养细胞，分别比较了星形胶质细胞与小胶质细胞的吞噬作用^3，4）。向原代培养脾脏巨噬细胞或星形胶质细胞中添加经pH敏感性染料（酸性条件下会发出荧光）标记的神经细胞碎片，观察其吞噬状态，发现在巨噬细胞中，5小时后可以确认到摄入至酸性囊泡的荧光；3天后由于死细胞凝集的细胞核消失，可以其确认分解。相比之下，在星形胶质细胞中，12天后才终于确认到死细胞核的消失。而且在此期间，几乎没有确认到显示酸性条件的荧光。从观察的结果可以看出，与巨噬细胞相比，星形胶质细胞在分解吞噬物质时需要更多的时间，而且溶酶体内的pH更高。Lööv等认为由于pH值高的缘故，分解吞噬物质时需要更多的时间，为了验证这一点，用可以引起溶酶体酸化的微小颗粒处理星形胶质细胞，结果证实5天后促进了分解。与巨噬细胞相比，星形胶质细胞的维持溶酶体维持高pH值的机理尚不清楚，但这可能是导致了分解吞噬物质在时间上的差异。

小胶质细胞与星形胶质细胞不仅限于在功能正常时下相互分担工作。根据小西等人最近发表的报告显示，如果利用遗传学的方法诱导小胶质细胞死亡，星形胶质细胞会在约4天内吞噬、去除小胶质细胞的残骸^5）。此外，当小胶质细胞的吞噬功能降低时，星形胶质细胞会代替其吞噬神经细胞等的死细胞碎片。换言之，当小胶质细胞的吞噬功能不足时，星形胶质细胞会作为替补发挥小胶质细胞的功能。

◆病理过程中的吞噬

在森泽等人进行的大脑中动脉闭塞（MCAO）引起的脑缺血模型研究中，直接比较了关于患病时星形胶质细胞与小胶质细胞吞噬的区别^6）。小胶质细胞存在于缺血核心区和半影区（血流量低但可避免细胞死亡的区域），吞噬大小各异的细胞碎片；而星形胶质细胞则在半影区中吞噬尺寸较小（小于10 μm²）的细胞碎片。

此外，比较吞噬标记Galectin-3（与吞噬功能相关的凝集素）和溶酶体标记的表达后，发现小胶质细胞从MCAO 开始3天后出现峰值，14天后恢复至对照水平；而星形胶质细胞在7天后达到峰值，14天后表达持续亢奋。另外，作为其分子机制，我们着眼于缺血时星形胶质细胞特异性表达升高的ATP-binding cassette transporter A1（ABCA1，脂质转运蛋白），发现ABCA1的敲除抑制了星形胶质细胞的吞噬作用。另外，由于在小胶质细胞中未观察到ABCA1的升高，可以推测小胶质细胞中有不同的运输途径。

◆突触的吞噬

在发育期，接受视神经投射的外侧膝状体（dLDN）中会对过量的突触进行突触修剪。有两个团队的报告显示，小胶质细胞和星形胶质细胞两者都参与了这种突触修剪^7，8）。报告称，两种细胞都有相关的受体，星形胶质细胞中是Mer tyrosine kinase（MERTK）和Multiple EGF-likedomains 10（MEGF10），而小胶质细胞中是补体途径的C3-CR3信号，如此通过互不相同的途径的突触吞噬机制。

但是，两者在神经活动依赖性地抑制吞噬作用这一点上是相同的。另外也有报告称，与小胶质细胞相关的除了C3-CR3之外，还有CD47-Signal Regulatory Protein α（SIRPα）信号发出“don't eat me”信号，以及Sushi repeat protein X-linked 2（SRPX2）这一内源性蛋白可抑制VGLUT2阳性突触的特异性吞噬^9，10）。

根据以上的见解，我们认为小胶质细胞的突触吞噬作用会通过多种信号途径精确地区分需要被去除的突触，但对于星形胶质细胞目前尚未进行详细的相关验证。

◆考察吞噬作用中的角色划分

在一般情况下和病理状态下，星形胶质细胞与小胶质细胞相比，更倾向于吞噬尺寸较小的细胞碎片^2，6）。另外还提出了，在摄取与分解方面与小胶质细胞相比，星形胶质细胞需要花费更多的时间，推测与溶酶体的pH有关^3，4）。另外，星形胶质细胞与神经细胞等其他脑细胞相同，都来源于外胚层，而小胶质细胞来源于中胚层，来源的不同造成的基本细胞特性的差异，也是在研究星形胶质细胞与小胶质细胞区别时的重点。

星形胶质细胞是维持大脑物理结构的重要支持细胞，在大脑不同区域中都有存在^11）。此外，考虑到星形胶质细胞具有辅助神经细胞功能的各种作用，在不引起大幅度结构变化的范围内进行吞噬，这样的行为更合理。

另一方面，小胶质细胞会持续不断地移动分支的突起，是非常活跃的细胞，在可迅速感知大脑中细胞死亡、病毒感染等的受体中大量表达，具有高游离性。而且由于在吞噬时可以变成使突起退缩的变形虫状形态，适合吞噬大型结构物质。像这样从细胞原始的功能和形态来分析，本文中介绍的吞噬作用的角色划分，可以说是发挥了每个细胞的特点。

另一方面，当小胶质细胞不存在或小胶质细胞的吞噬功能不足时，星形胶质细胞会吞噬平时不吞噬的尺寸和数量的死细胞碎片。虽然增强星形胶质细胞吞噬作用的机制尚不明确，但有推测在正常情况下小胶质细胞可能会抑制星形胶质细胞的吞噬^2，5）。无论如何，星形胶质细胞作为小胶质细胞吞噬功能候补的这一点对于生物来说至关重要。

另外，关于时间范围上的差异，有推测提出当小胶质细胞吞噬量达上限时，作为候补的星形胶质细胞的吞噬功能会提高^12）。然而Damisah等人的实验表明，即使小胶质细胞不存在，星形胶质细胞也可能会对细胞体大小的尺寸进行吞噬（但需要时间）。结合这些见解综合考虑，认为星形胶质细胞吞噬物质的缓慢分解是由于诱导吞噬的分子机制不同造成的（而不是依赖于小胶质细胞的机制），但这种差异是否利用了生物学的优势还尚未清楚。

Lööv等人主张星形胶质细胞是为了进行抗原呈递才维持溶酶体的高pH，以抑制抗原分解的假说^3）。但实际上目前的报告中仍没有说明星形胶质细胞具有抗原呈递功能，另外包括小胶质细胞会进行抗原呈递的可能性，这些都是今后的尚待验证的课题。为了详细阐明星形胶质细胞和小胶质细胞在吞噬作用中的角色划分，需要清楚以及直接比较两种细胞的受体活化、摄取、溶酶体形成、分解等吞噬各个过程中的分子机制。

关于突触吞噬，每个突触的兴奋性和抑制性等性质特点，可能决定了是被星形胶质细胞还是被小胶质细胞吞噬。如先前所述，近年显示小胶质细胞通过多种因素严格控制突触吞噬。在此背景下，如今我们认为小胶质细胞是突触吞噬作用的主要负责方，关于星形胶质细胞更详细的突触吞噬控制尚待求证。因此，有必要同时确立星形胶质细胞和小胶质细胞的突触吞噬的成像系统。

◆结语

虽然从星形胶质细胞和小胶质细胞吞噬角色划分的观点出发进行了比较，但同时在相同条件下比较两种细胞的见解依然很少。除了本文介绍的突触和凋亡细胞外，还有报告称淀粉样蛋白β和髓磷脂等也会被星形胶质细胞和小胶质细胞两者吞噬^13，16）。关于这些吞噬作用的对象，通过进行细胞类型特异性基因操作同时比较星形胶质细胞和小胶质细胞，阐明详细的分子机制，从而使星形胶质细胞和小胶质细胞之间的角色划分更明确。

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16）Hughes, A. N. et al. : Nat. Neurosci., 23（9）, 1055（2020）.

拥有这些抗体，与FUJIFILM Wako一同揭秘小胶质和星形胶质细胞相爱相杀的微观世界吧！

小胶质细胞标记物

胶质细胞标记物

吞噬标记物

第一回 神经性疼痛

小胶质细胞研究前线~从基础到临床~

九州大学大学院药学研究院生活创新领域 津田诚

“小胶质细胞研究前线~从基础到临床~”系列的寄语

在发现小胶质细胞100周年之际，Wako举办了第35届Wako研讨会“小胶质细胞研究前线~从基础到临床~”（2019年11月）。此次作为和光纯药时报的系列文章，获得了连载“小胶质细胞研究前线”的好机会。神经胶质（glia；英文为glue），顾名思义神经胶质过去曾被认为是填充神经和神经之间间隙的胶状物质（neuroglia），但从最近的基础研究中，不断表明神经胶质是对神经活动有很大影响力的重要细胞。尤其是在现代医疗中，已明确了小胶质细胞在仍然难以克服的神经系统疾病中具有重要作用。因此以小胶质细胞为起点阐明疾病的机制并开发诊断和治疗方法的期望不断增高。在本系列中将邀请日本多位专业资深的老师来给我们分享有关在神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、癫痫、脑梗塞、精神疾病、慢性疼痛等中有重要作用的小胶质细胞的新知识以及展望。敬请期待。

◆前言

在对生物体施加有害刺激时，我们会利用痛觉系统产生疼痛并采取适当的防御措施。但是，晚期癌症或糖尿病、脑梗塞、脊髓损伤和带状疱疹治愈后，神经系统受损或受压迫引发功能障碍的话，就会发生被称为神经性疼痛的慢性疼痛。症状为自发性疼痛、痛觉过敏以及触觉刺激等一般不会引起疼痛的刺激引起的异常性疼痛。这些疼痛并不是单纯作为生物防御而不断产生的痛觉信号，比如像异常性疼痛那样的感觉方式本身发生了变化的症状，可能是由于体感信息传达系统的功能被破坏了。但是，在周围组织→初级传入神经→脊髓背角→大脑有关的神经传递系统中究竟是怎样的结构引起异常，其机制尚未阐明。在本文中，主要介绍小胶质细胞在脊髓和大脑中产生的痛觉传达异常中发挥的重要作用，并介绍由此产生的神经性疼痛机制以及今后的展望。

◆小胶质细胞

小胶质细胞是组成中枢神经系统的神经胶质细胞之一。成熟小胶质细胞存在于具有多个细小分支突起的小细胞体中（图1）。大脑小胶质细胞的生物成像分析表明，小胶质细胞经常活动其突起，以应答突触活动和细胞损伤等，在时空上拥有非常动态的活动性^1）。从2010年以后开始的fate-mapping研究认为，小胶质细胞起源自存在于胚胎卵黄囊中的祖细胞，并通过血流移动至大脑并分化、成熟形成小胶质细胞^2）。现在，小胶质细胞被分类为中枢神经系统的组织驻留巨噬细胞。为了维持成熟的小胶质细胞，自我更新的理论替代了以往的骨髓细胞供给理论。虽然详细情况还没有被阐明，但在细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）缺失^3）、抑制剂治疗^4）和白介素-34（IL-34）缺乏^5）时，小胶质细胞数量会减少或消失，由此可以看出，这些都是维持的重要信号。

图1. 正常状态的小胶质细胞（脊髓背角）

 IBA1抗体免疫组织染色图像。比例尺：50 μm

◆脊髓背角小胶质细胞

在神经性疼痛的基础研究中，使用了周围神经直接损伤（主要是坐骨神经和腰椎神经）的动物模型。在1970年代，报道了由于切断坐骨神经从而激活了脊髓背角的小胶质细胞，之后在1990年代提出了神经性疼痛与小胶质细胞间的相关性，而在2003年首次明确了两者间的因果关系^6）。此后，小胶质细胞作为神经性疼痛机制被全世界关注，至今为止小胶质细胞的研究仍然十分活跃。下文将概述至今为止已经阐明的分子细胞机制。

<小胶质细胞的激活机制>

由于周围神经损伤，脊髓背角的小胶质细胞显示出如细胞体肥大、突起收缩以及细胞数量急剧增加等剧烈的细胞应答^7）。细胞数的增加与小胶质细胞自身的细胞分裂引起的自我增殖相关。其分子机制是在受损神经中，具有双亮氨酸拉链激酶（DLK）依赖性的CSF1表达增强，通过神经轴突转运至脊髓背角，作用于小胶质细胞的CSF1R，这一假设比较有说服力^8,9）（图2）。另一方面，在与血脑屏障破坏相关的疾病模型的脑和脊髓中，观察到了外周血来源的单核细胞/巨噬细胞的浸润。在神经性疼痛模型中，虽然神经损伤后血液脊髓屏障的功能会暂时降低，但是未观察到外周血来源单核细胞在脊髓背角内的浸润^10）。

图2. 脊髓背角的小胶质细胞激活和神经功能调节机制

受损后的原发传入神经表达的CSF1增强，与脊髓背角的小胶质细胞的CSF1受体作用，并伴随形态变化、细胞增殖和基因表达被激活。P2X4受体通过IRF8-IRF5转录因子级联表达增强。脊髓背角中间神经元释放的ATP刺激P2X4受体，从小胶质细胞释放体液因子。BDNF通过KCC2的表达降低来提高细胞内Cl^– 的浓度，并将GABA和甘氨酸的作用转化为兴奋性。其神经兴奋，TNFα和IL-1β亢进了谷氨酸受体的功能，引起脊髓背角神经的过度兴奋，导致神经性疼痛。

<通过激活小胶质细胞的感觉传递调节机制>

激活的小胶质细胞在表观基因组水平上发生变化^11），并通过细胞膜受体、细胞内磷酸酶和体液因子等各种基因表达功能性激活^6）。作为代表性的分子，例如ATP等的细胞外核苷酸的受体（P2受体）。神经损伤后的脊髓中，离子通道型的P2X4和P2X7受体以及G蛋白偶联的P2Y12受体的表达主要在小胶质细胞中特异性增加，并且其功能和表达的阻碍明显抑制了了异常性疼痛^6,12）。P2X4受体的表达增强是由于转录因子IRF8和IRF5的诱导^13,14）。同受体被从脊髓背角中间神经元释放的ATP激活^15），产生并释放大脑来源神经营养因子（BDNF）等的体液因子。这使向大脑传达疼痛信息的脊髓背角神经KCC2的表达降低，扰乱细胞内外的Cl^－浓度梯度。将GABA和甘氨酸的作用转为兴奋性^16），这还导致NMDA受体的激活，最终引起同一神经的异常兴奋（图２）^6）。

小胶质细胞是大脑和脊髓中炎性细胞因子的主要产生细胞。IL-1β通过TREM2 / DAP12、toll样受体（TLR）和NLRP3炎症小体产生，亢进了脊髓背角神经中谷氨酸受体功能，并抑制了GABA受体和甘氨酸受体功能^6）。TNFα在小胶质细胞中选择性表达，除了直接作用于脊髓背角神经外，还通过间接作用于星形胶质细胞和血管内皮细胞提高神经的兴奋性。此外，TNFα作用于小胶质细胞来提高BDNF的表达，增加疼痛传递神经的脊柱结构和突触连接^17）。另外，小胶质细胞释放的血小板激活因子（PAF）形成刺激自分泌小胶质细胞的PAF受体并诱导PAF产生的正循环，与神经性疼痛相关^18）。

◆大脑小胶质细胞

尽管与脊髓背角的小胶质细胞相比，形态变化并不大，但是周围神经损伤时在多个大脑部位被激活。在支配奖赏系统的腹侧被盖区激活的小胶质细胞与中脑边缘系统多巴胺能和奖赏系统的降低相关^19）。海马小胶质细胞与CA1金字塔型脊柱密度、突触传递、BDNF表达水平以及记忆力降低有关^17）。另一方面，在中央杏仁核中，外周血来源单核细胞/巨噬细胞在相对较晚的时期（神经损伤后4周）浸润，这与NMDA受体的磷酸化和焦虑行为有关^20）。因此，笔者认为大脑中激活的小胶质细胞与神经性疼痛的情绪和记忆等相关。

◆治疗和诊断的发展

包含P2X4受体在内，已开发了多种靶向小胶质细胞表达分子的化合物和抗体，其有效性都在非临床测试中有报告^6,21）。笔者期望它的有效性能在以神经性疼痛患者为对象的临床测试中显示出来。

人脑和脊髓中的小胶质细胞成像技术可以应用于药物发现、治疗和诊断。尽管小胶质细胞的活检非常困难，但是九州大学的加藤隆弘等人的研究小组发现，在纤维肌痛患者外周血中，从单核细胞分化出的小胶质细胞样细胞（iMG细胞）中发现了TNFα释放能高，这与疼痛相关^22）。期望未来进一步的研究中，iMG可以应用于慢性疼痛的诊断和治疗。

◆结语

根据至今十几年间积累的大量研究结果表明，神经性疼痛的病发不仅是神经，也与伴随神经受损的脊髓背角和大脑激活的小胶质细胞有重要关系^6）。另外，还有报告显示星形胶质细胞也参与神经性疼痛（请参考其他总论^23））。迄今为止，神经胶质细胞一直被认为是仅支持神经的细胞，但这些研究表明，神经胶质细胞的活动对神经功能有极大的影响。根据神经性疼痛机制和中枢神经功能来看，神经和神经胶质间相互作用的观点很重要。另一方面，最近细胞分析显示的小胶质细胞的异质性在神经受损后如何崩溃，以及它对慢性疼痛拥有什么意义是完全未知的，这将是今后一个重要的课题。未来，通过阐明小胶质细胞亚群的作用以及与神经的相互作用，笔者相信可以开辟一条阐明神经性疼痛机制和开发治疗药物的重要途径。

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鉴定小胶质细胞的标记物。众多文献引用。产品质量稳定。小胶质细胞属于神经免疫细胞，在当前神经生物学研究的热点。包括从事眼科研究，神经退行性疾病的客户会用到该产品。

文献报道可用于石蜡切片和冰冻切片的免疫组化（IHC）实验。

样品前处理：1/本产品请在冰上解冻。2/溶解后，请根据用途需要来稀释抗体。保存的时候使用2xTBS溶液稀释。实验中请使用封闭液。