一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染很容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染，据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是最主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂慢慢蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。

狡猾的支原体

支原体是一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小，而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。

检测、检测、再检测

对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心，它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明没有支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。

支原体检测：

检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析，ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该是检测支原体的理想方法，他综合了几个优势，灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可以直接用来检测，非常方便。Applichem公司提供的高灵敏度PCR Mycoplasma Test Kit（A3744）,该试剂盒引物源于支原体基因的保守序列，而且即用型的PCRmix使您的使用更加方便，同时更是提供了阳性对照。当然为了避免假阳性和假阴性，试验中必须设立多种对照：除了阳性对照外，还有阴性对照和内对照。

用Hoechst33258染料检测支原体是很多教科书上推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechest33258染料结合，在500倍数放大情况下，表现为细胞颗粒或纤毛染色。但操作过程较为繁琐，且需要一定的经验辨别支原体，新手可能大不容易掌握。

支原体污染和清除：

如果很不幸，你的细胞已经感染了支原体，怎么办？大部分人的想法可能都是把感染的细胞扔掉，重新开始。一旦感染了支原体，细胞复原的机会很小。所以在液氮中多储存一些备份还是比较明智的选择。

如果你的细胞非常稀有且珍贵，那只能去奋力抢救了。拿什么拯救你，我的细胞？由于支原体没有细胞壁，且代谢慢，故大部分传统的抗生素都不奏效。但是上海金畔公司提供了一些Applichem的支原体清除试剂。Myco-3（A5240），Myco-1（A5222）Myco-2(A5233)。这三类支原体清除试剂是有多种支原体敏感的抗生素研制而成，无细胞毒性。100倍浓缩液直接加入培养基，使用方便。具体的使用方法如下：

Myco-3加入培养基中，每2-3天换液一次，连续处理14天，可有效清除绝大多数支原体污染。

顽固支原体需Myco-1和Myco-2联合使用：Myco-1处理4天后换Myco-2处理3天，如此重复2-3次。

支原体预防：

虽然说支原体可以铲除，但这种劳心劳力的事情估计没有人愿意做，那么平时的预防更重要。上海金畔公司还提供了几样好东西，能预防支原体的污染。具体介绍如下Incubator-Clean（A5230）

用于CO2培养箱的消毒，喷一喷，彻底预防支原体、细菌和病毒等的污染。

Incuwarter-Clean（A5219）

用于CO2培养箱内保持空气湿度的水源消毒，100*即用型浓缩液。

Aquabator-Clean（A5225）

用于水浴的消毒，有效防止各类污染。

需要特别提及的是，液氮罐中也可能有支原体。支原体能耐受液氮的低温，虽然不会增殖，但会污染你的细胞。因此，细胞冻存管还是不要放在液氮内，以免液氮渗进入细胞，而是储藏在液氮的气相中。

不过，预防支原体污染的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。下面我将上海金畔公司提供的有关支原体预防，检测和清除的产品做一个总结：

支原体预防：

支原体检测：

支原体清除：

除了支原体预防，检测和清除方面的试剂外，上海金畔公司还提供了Applichem细胞培养相关方面的其他试剂，包括各种细胞培养基，氨基酸，抗生素以及糖和盐类。同时也包含了常用的其他生化试剂，如有需要可随时拨打我们的电话：021-50837765.

细胞冻存过程中,为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤, 需要冷冻保护剂。二甲基亚砜（DMSO）能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程, 同时提高细胞内离子浓度, 减少细胞内冰晶的形成, 从而减少细胞损伤，是目前广泛使用的的细胞冷冻保护剂。

AppliChem的专业细胞培养级二甲基亚砜（货号A3672），原产地德国，以其高纯度，超低金属离子含量等质控数据，严格符合细胞培养级标准。与血清或细胞培养基配合使用，为细胞提供全方位的保护。质优价廉，一直受到广大客户的青睐，年销售数千瓶 。

DMSO/二甲基亚砜除作为细胞冻存剂外，还可作为无机溶剂，广泛应用于生化试验、高效液相色谱HPLC、气相色谱GC、辅料等领域。配合这些应用，AppliChem还可以提供：

随着国家药品监督管理部门对药品生产监管力度越来越大，生物制药和疫苗生产企业对产品安全性管理要求越来越高，在疫苗生产过程中采用无动物源成份的原辅料是日益增长的要求趋势，但目前，绝大部分疫苗生产还离不开细胞培养过程中血清成份的添加，但使用血清，必须面对血清带来的系列问题和缺点：

1.     批间差较大：每批血清可能适合某些细胞系，换血清批号要做广泛实验，大量储存提高成本，且很难实现大规模生产过程的标准化，也在一定程度上影响疫苗的批次稳定性；

2.     污染风险：血清常受病毒污染，虽对多数细胞培养无害，但增加了不能控制的因素，一旦出问题，需要耗费相当大的时间、物资和人力成本去解决；

3.     不确定性：血清中含有广泛的未知微量成分，对其存在的作用还远未搞清楚，也增加了纯化和疫苗质量控制的难度；

4.     高成本：高质量血清供应不足，全球血清趋紧，且价格仍不断上升，成本往往是细胞培养基成本的数倍，给疫苗生产企业带来相当大的成本压力；

因此，如何降低血清在疫苗生产中的用量，从而减少使用血清带来的风险和高成本，是疫苗生产企业广泛关注且努力寻找解决方案的重要问题。

与传统的高血清含量细胞培养相比，采用低血清细胞培养方式，不仅能够降低疫苗安全性风险，还能提高企业生产效率，使用低血清培养基进行疫苗生产，细胞经驯化适应后，与传统培养方式相比，细胞数量有显著提高，细胞长满单层时间大大缩短，分种比例、病毒滴度也有所提高，同时减少劳动强度，从而大大提高企业的生产效率，最重要的是，降低了疫苗生产企业的综合成本。

上海金畔生物科技有限公司（以下简称上海金畔生物科技有限公司）为疫苗客户引进全球知名培养基营养添加物供应商——KERRY，其高品质的植物源蛋白水解物、复合非动物源性添加物系统、超滤酵母粉、重组低内毒素白蛋白服务于全球疫苗生产企业、培养基生产企业近70年，为广大疫苗客户很大程度上解决了血清带来的困扰。目前在国内，KERRY系列产品已经广泛应用于疫苗生产的BHK、VERO、SF-9、MDCK、MRC5等细胞株中，上市疫苗品种有：口蹄疫疫苗、戊肝疫苗、流感疫苗等，血清使用量已经从从10%降低到3%，少数客户已经实现了完全无血清培养。

使用KERRY Sheff-VAX系统用于VERO细胞降血清驯化案例

图1. Vero细胞生长形态对比。（A）对照组：10%胎牛血清；（B）：实验组：0%胎牛血清+2g/L Sheff-VAX ACF。根据观察，A对照组中的Vero细胞和B实验组的细胞没有不同。所有图片都是用100X莱卡显微镜拍摄。

图2. 以Vero细胞在含有10%的胎牛血清的培养基中生长曲线为对照组，对比细胞在逐渐减少血清的情况下加入Sheff-Vax添加物进行细胞穿戴。DMEM作为基础培养基。（i）10%胎牛血清；（ii）7.5%胎牛血清；（iii）5%胎牛血清；（iv）2.5%胎牛血清；（v）1.5%胎牛血清；（vi）1%胎牛血清；（vii）0.5%胎牛血清；（viii）0.25%胎牛血清；（ix）0.1%胎牛血清；（x）0 %胎牛血清。用逐渐减少血清的方法，可以实现Vero细胞的无血清培养。在同样的培养基时间内，有添加物培养基中的细胞可达对照组细胞密度峰值的一半。但通过延长培养时间，可获得更高的细胞密度峰值。

推荐疫苗生产细胞培养添加物系列产品介绍：

1. 全球独家非动物复合添加物Sheff-VAX系列

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2. 非动物源Hypep系列

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由于低血清培养基在成分配比上与基础培养基有所不同，其培养液的pH、渗透压及碳酸氢钠添加量等有所改变，以及细胞生长速度、分种比例、收毒时间及次数等都与用户以往的经验和习惯不同，在使用低血清培养基时，容易给用户造成一定的困难。因此，要使用好低血清培养基，用户必须打破以往形成的使用习惯，以一种全新的姿态来认识低血清培养基。我们可以提供以上产品的试用装，用于您工艺优化小试，如果您对以上产品感兴趣，欢迎联系KERRY细胞营养产品中国独家一级代理商——上海金畔生物科技有限公司。

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