dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用

随着全球对新冠病毒治疗药物广泛而深入的研究,抗双链RNA抗体成为抗病毒药物研发过程中不可或缺的重要工具。本文综述了一种新冠病毒治疗药物的研发进展,通过利用小鼠抗双链RNA单克隆抗体检测新冠病毒感染后的双链RNA,从而发现了一系列潜在抗病毒药物在抑制SARS-CoV-2及其突变株对细胞感染的有效性。

SARS-CoV-2,俗称COVID-19,是一组正链、单链RNA (ssRNA)病毒,这类病毒还包括丙型肝炎病毒、登革病毒、中东呼吸综合征病毒和西尼罗河病毒。韦伯等人在2006年的一篇论文1中证明了,被这些正链RNA病毒感染的细胞,在病毒复制过程中会产生双链RNA (dsRNA),可作为中间体被检测到。SCICONS抗双链RNA抗体J2可检测这种中间体,从而能够确认病毒感染,以及病毒在宿主细胞内的复制。

在一项加拿大和美国的联合研究中,科学家们通过靶向II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP) TMPRSS2阻止COVID-19病毒感染,TMPRSS2是一种蛋白酶,介导COVID-19刺突蛋白的切割,在这项新的靶向治疗方法研究中,J2克隆被用来评估抗病毒化合物的效力,这些抗病毒化合物是通过阻止病毒进入宿主细胞而预防感染的。

Shapira等人,开发了一个新型小分子TMPRSS2抑制剂文库作为潜在的治疗药物2,科研人员用潜在治疗剂在肺上皮细胞系(Calu-3)和人活组织来源的结肠膜上进行预处理,然后感染多种SARS-CoV-2毒株。通过免疫荧光对固定细胞染色,用J2抗体检测双链RNA (J2克隆)和核衣壳蛋白的存在,成功检测到COVID-19感染。通过荧光染色方法监测治疗剂文库中化合物感染减少的百分比,反应剂量分析及进一步研究显示,小分子化合物N-0385是一种纳摩级、广谱的SARS-CoV-2冠状病毒抑制剂,对备受关注的B.1.1.7(英国)和B.1.351(南非)两种变异株仍然有效。在对K18-h ACE2转基因小鼠SARS-CoV-2疾病模型的研究数据表明,在感染早期通过鼻腔给药化合物N-0385,临床效果改善明显,存活率可达100%,而对照组仅为20%。

SCICONS小鼠抗双链RNA单克隆抗体(J2已成为双链RNA检测的金标准。它可以用于检测多种病毒的双链RNA中间产物,如丙型肝炎病毒、登革病毒、鼻病毒、基孔肯雅病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、典型猪瘟病毒、雀麦花叶病毒和培养细胞中的病毒,也可以用于石蜡包埋的组织样品检测。更多关于小鼠抗双链RNA抗体J2的信息可在Nordic MUbio公司官网查阅,产品代码为10010200/10010500,为了方便大家查找,小编汇总了SCICONS产品信息表:

货号

英文品名

中文品名

规格

10010200

Mouse anti double-stranded RNA (J2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)

200 µg

10010500

Mouse anti double-stranded RNA (J2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J2)

500 µg

10040200

Mouse anti double-stranded RNA (J5)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)

200 µg

10040500

Mouse anti double-stranded RNA (J5)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (J5)

500 µg

10020200

Mouse anti double-stranded RNA (K1)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)

200 µg

10020500

Mouse anti double-stranded RNA (K1)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K1)

500 µg

10050100

Mouse anti double-stranded RNA (J2, J5 and K1) Comparison Kit

小鼠抗双链RNA单克隆抗体(J2,J5 and K1)组合试剂

3 x 100 µg

10613002

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)

Kit

10623002

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)

Kit

10623005

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (K1 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(K1)

Kit

10613005

Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA kit (J2 based)

双链RNA (dsRNA) ELISA试剂盒(J2)

Kit

10030010

Mouse anti double-stranded RNA (K2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)

10 ml

10030005

Mouse anti double-stranded RNA (K2)

小鼠抗双链RNA单克隆抗体 (K2)

5 ml

dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用

SCICONS是一家提供与双链RNA分子杂交的小鼠单克隆抗体的厂家,客户遍布世界很多国家和地区,在美国有超过一半的州都在使用SCICONSdsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用的单克隆抗体。SCICONS在1990年便dsRNA抗体J2在新冠病毒治疗药物开发中的应用开始利用杂交瘤细胞系生产抗双链RNA(anti-dsRNA)的单克隆抗体,此类抗体的特异性非常强,包括J2、K1和K2小鼠单克隆抗体。SCICONS的客户包括许多研究机构的学者,发表的文章超过200多篇。

SCICONS于2021年4月13日被Nordic-MUbio BV收购,Nordic-Mubio是一家专注于免疫学的研究试剂公司,总部设在荷兰的Susteren,公司拥有广泛的产品组合,可应用于流式细胞术、细胞生物学、免疫学、癌症研究、干细胞等研究领域。

上海金畔是Nordic MUbio品牌中国区一级代理,为客户提供完善的技术支持与售后服务。关注“金畔生物科技”官方公众号,更多海量免疫学产品等您发现!上海金畔生物科技有限公司集结了全球高质量抗体及抗体相关产品和服务供应商,如Nordic-MUbio、Lifespan、MyBioSource、KPL、Everest和Cal Bioreagents等。品牌知名、产品优质、种类齐全,为科研工作者以及生物制品生产企业提供一站式的服务。如对上述产品感兴趣,欢迎随时拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录上海金畔生物科技有限公司官网www.jinpanbio.cn查询订购。

Reference

  1. Weber F ,  Wagner V ,  Rasmussen S B , et al. Weber, F, Wagner, V, Rasmussen, SB, Hartmann, R and Paludan, SR. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. J Virol 80: 5059-5064[J]. Journal of Virology, 2006, 80(10):5059-5064.
  2. Shapira T ,  Monreal I A ,  Dion S P , et al. A novel highly potent inhibitor of TMPRSS2-like proteases blocks SARS-CoV-2 variants of concern and is broadly protective against infection and mortality in mice.  2021.

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

常用的病毒基因传递载体包括逆转录病毒(RV)、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)和单纯疱疹病毒(HSV)。其中,AAV属于细小病毒科,是其中最小的单链和无囊膜DNA病毒,目前已发现的血清型有11种。在所有不同血清型的AAV中,重组AAV-2是最常用的一种,它可以通过辅助病毒或Cell Biolabs提供的AAV Helper-Free System来体外生产出高滴度的重组病毒。AAV-2可以感染分裂细胞和非分裂细胞,并能在人类宿主细胞中维持,具有一定的基因稳转潜力。由于AAV-2是一种天然缺陷型病毒,需要在反式结构中提供若干因子才能进行生产性感染,因此被公认为最安全的病毒载体。近年来,利用DNA重组技术开发了一种新型的载体AAV-DJ,是从8种不同血清型AAV重组而来的一个混合衣壳,使其能在各种不同细胞和组织中都具有显著较高体外感染效率的载体。重组的AAV-2和AAV-DJ病毒都可通过CsCl梯度超离法、碘二醇密度梯度超离法或Cell Biolabs的AAV纯化试剂盒来纯化。

利用病毒载体来转导基因必须要准确地测量病毒滴度。传统检测AAV滴度是通过DNA斑点杂交或类似方法来定量AAV基因组拷贝数(GC)。然而这些方法耗时耗力,且稳定性不佳。对于已经高度纯化的病毒样品,也通常用其在260nm的吸光度来估算病毒粒子总数,但这种方法不适用于未纯化的病毒上清,因为其中的杂质成分会影响260nm的光吸收度。

上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs提供了一种快速全面的用于检测纯化后的AAV滴度的试剂盒QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit。该试剂盒包含一个96孔板和足够检测96个样本的试剂,包括已灭活的AAV标准品,通过标准曲线能够计算出样品中纯化后的AAV滴度。该试剂盒检测灵敏度为6.25×108 GC/mL,能够检测AAV-1,AAV-2,AAV-3,AAV-5,AAV-6,AAV-8,AAV-9,AAV-10,AAV-DJ和AAV-DJ/8多种血清型的AAV滴度,并且适用于所有表达系统生产的AAV。

检测原理

AAV衣壳是由VP1、VP2和VP3三种蛋白质混合构成,平均每一个病毒粒子中包含60个VP分子,其比例为5 VP1 : 5 VP2 : 50 VP3。试剂盒中提供的96孔板已预包被了可以结合三种VP蛋白的捕获抗体,当AAV样品或标准品加入到96孔板中,其AAV衣壳蛋白就会与捕获抗体结合。经过孵育和洗板等步骤后,再分别加入AAV VP衣壳抗体和HRP标记的二抗,而未结合的抗体将被洗脱下来。经底物显色后,测定450nm处的吸光度,最后通过AAV标准曲线计算未知样品中AAV衣壳蛋白浓度,进而计算出样本中AAV滴度。

下图展示了AAV滴度检测试剂盒的标准曲线结果。

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

产品特点

  • 通过检测纯化后的重组AAV衣壳蛋白来确定AAV滴度;
  • AAV定量结果由标准酶标仪读取;
  • 试剂盒中提供灭活的AAV标准品;
  • 适用于多种血清型AAV滴度测定,包括AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-5, AAV-6, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-DJ and AAV-DJ/8

产品信息

货号

品名

规格

VPK-5146

QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit

96 assays

VPK-5146-5

QuickTiter™ AAV Titer ELISA Kit

5 x 96 assays

新品上市 | 腺相关病毒(AAV)滴度检测试剂盒

Cell Biolabs公司坐落于美国加利福尼亚州圣地亚哥市,一直致力于开发生命科学研究领域的技术和工具,并将所开发的创新性技术成果商业化。Cell Biolabs孜孜不倦的完善产品,以期使细胞功能和疾病机制研究达到新高度。Cell Biolabs公司的产品独具特色并且处于行业前沿水平,全球众多大学、政府研究机构、生物、制药企业的科研实验室均在使用。上海金畔生物科技有限公司是Cell Biolabs中国一级代理,为用户提供完善的技术支持与售后服务。如您对上述产品感兴趣,欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

引用文献

1. Rabinowitz, J, and Samulski, R. J. (1998) Curr. Opin. Biotechnol., 9, 470-475.

2. Summerford, C., and Samulski, R. J. (1999) Nat. Med., 5, 587-588.

3. Clark, K., Liu, X., McGrath, J., and Johnson, P. (1999) Hum. Gene Ther., 10, 1031-1039.

4. Sonntag, F., Schmidt, K., and Kleinschmidt, J.A. (2010) Proc Natl Acad Sci U S A., 107, 10220-5.

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性,全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的,其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒(AAV)载体常被用于基因治疗,而慢病毒(LV)载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的,而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一,对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物,如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内,但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步,但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此,优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感,从中筛选出适合病毒生产的混合配方,将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力,Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂,它不仅仅是基于PEI或脂质体,而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物(LPNC),能够高效地结合和包裹DNA,将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中,然后将其从细胞核内释放,以便同时满足2-4个不同的质粒的表达,这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时,Mirus还研发出了一种完全合成的(无动物源)转染增强剂(Enhancer),与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时,可以进一步提高病毒滴度。另外,为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求,Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品,以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明,Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台(贴壁和悬浮)、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比,在不使用增强剂的情况下,病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后,在合适的培养条件下,病毒产量甚至能够提高10倍以上!(结果见下图1-5)

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

图1. 基于脂质聚合物纳米复合物(LPNC)和聚乙烯亚胺(PEI)配方的转染试剂用于腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体生产的性能对比。分别用基于LNPC的TransIT-VirusGEN试剂(不含增强剂与含增强剂)、25kda PEI和基于PEI技术的竞争品牌A3转染试剂产生AAV(左)和LV(右)。以LPNC为基础的TransIT-VirusGEN转染试剂比以PEI为基础的转染试剂的病毒颗粒表达量高3-5倍。当TransIT-VirusGEN和增强剂同时使用时,比单独使用TransIT-VirusGEN大约提升了一倍。转染试剂 : DNA的比值为体积 : 质量。

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

图2. TransIT-VirusGEN转染试剂在不同细胞培养基中的表现。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生产细胞进行转染,该细胞适应四种不同的培养基配方,分别来自Thermo Fisher公司的LV-MAX培养基、Expi293表达培养基、FreeStyle F17表达培养基和来自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培养基。后一种培养基的AAV总效价较高,但在所有使用的培养基中,无论是否添加增强剂,TransIT-VirusGEN转染试剂均表现优异。DNA与转染试剂配比为2μg DNA :3μl转染试剂,转染细胞密度为2.0×106个/ml。生产LV也获得了类似的结果(数据未显示)。

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

图3. 分别在四种不同的转染条件和两个不同的收获时间,测定TransIT-VirusGEN转染试剂和PEI为基础的转染试剂A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F细胞生产AAV2-GFP。转染48小时和72小时后收获的病毒分别测定功能滴度TU/mL(左)和物理滴度GC/mL(右)。结果显示用TransIT-VirusGEN转染试剂和增强剂转染收获的病毒效价最高。此外,TransIT-VirusGEN转染试剂比PEI为基础的转染试剂的表达更快。这些结果表明,对于病毒滴度的评估,功能滴度可能是一个更可靠的指标。因此,建议测试几个不同的收获时间点来确定最佳方案。

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

图4. 每种培养体系都应优化转染时的细胞融合度和接种密度。用DMSO+10%胎牛血清培养贴壁的HEK293t/17细胞生产慢病毒(1μg DNA/mL)。试剂盒包括TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN LV复合物形成溶液和VirusGEN LV增强剂。

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

图5. 在Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞,使用VirusGEN AAV转染试剂盒,内含TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN AAV复合物形成溶液和VirusGEN AAV增强剂,在悬浮细胞培养中生产AAV。分别用2:1(左)和3:1(右)两种比例来确定理想的转染试剂和DNA配比(体积:质量)。每种转染体系都应对转染试剂: DNA配比及每毫升细胞所需的总DNA量进行优化。

TransIT-VirusGEN转染系列产品信息

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

 

高效率低成本的GMP转染方案,解决细胞和基因治疗生产中的关键问题!

美国Mirus公司成立于1995年,是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司之一,同时也是目前该类试剂主要的供应商之一。Mirus被公认为转染试剂开发的领跑者,其许多杰出成果获得世界公认与广大用户的好评。

上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务。如果您对上述产品感兴趣,欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息或申请试用。

引用文献:

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

(https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf)

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

Cygnus Technologies 近日宣布将MockV  Solutions公司旗下产品线整合至CygnusTechnologies品牌中。Mock VSolutions是一家研发生物工艺中病毒清除情况检测产品的公司。MockV Solutions的加入使Cygnus Technologies产品线进一步扩大,并进一步确立其在全球生物工艺污染物检测的领先地位。

在治疗药物产品的生产中,例如抗体药物、疫苗产品、血液制品等,病毒污染是一项固有的风险,它不仅可以导致工厂停工,更严重的情况下,可以影响药品安全及病人身体健康。中国NMPA、美国FDA、欧洲CPMP/BWP以及ICH等全球的药品监管机构都需要制药企业对产品中病毒清除/灭活的情况进行验证。并且,各机构对产品研发的不同阶段所需要验证的项目和标准也有所不同。例如,IND阶段,需要对以逆转录病毒、细小病毒和疱疹病毒的清除能力做出验证。病毒清除情况的验证通常需要通过活病毒实验来完成。但是由于开展活病毒实验需要对实验场所、设备、人员等有着一系列特殊的要求,这给这项验证工作和生物技术企业带来了很多挑战。而且如果验证失败,将在金钱和时间上造成过大的损失。

MockV Solutions开发了一种基于Mock Virus Particles(MVPs)的技术用于工艺中病毒清除情况的确认。MVPs的形态、理化性质以及功能都类似于病毒,但不具有传染性。因此可将MVPs作为活病毒的替代品加入并应用到纯化过程中,再对纯化后得到的溶液进行Immuno-qPCR检测确定病毒清除情况。

现阶段MockV Solutions已经推出MVM-MVP试剂盒(货号M-219),即模拟小鼠细小病毒(MVM)的MVP试剂用于病毒清除研究(MVM是一种模式细小病毒并常用作生物制药工艺验证的国际监管标准)。同时,MockV Solutions还在研发用于模拟逆转录病毒的清除验证相关产品(RVLP),预计于2021年上市。

现阶段由于这项技术刚刚应用不久,MVM-MVP等试剂盒还不能完全替代产品最终申报时采用活病毒所做的验证。但这些试剂盒可以在真正开展活病毒验证前,以一种经济实用的方式积累数据提供理论基础。当有了多年研发工艺中积累的这些有效和稳定的数据时再开展活病毒验证会避免验证的失败,从而减少潜在的时间和金钱损失。同时,MockV团队已经与FDA共同开展了一些研究(如Characterization of Non-Infectious Virus Like Particle Surrogates for Viral Clearance Application. Johnson et al. 2017)来比较MVM-MVP与活病毒验证的差异,并正在推动MVP技术至少可以替代IND阶段的活病毒验证数据的工作。所以,从工艺初期就采用MVM-MVP试剂盒对病毒清除情况进行验证,不仅可以在长期的研发阶段中积累重要的数据,更有可能在未来产品申报时减少验证工作量和时间。

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

MVM-MPV试剂盒Immuno-qPCR检测原理

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

作为Cygnus中国一级代理商,上海金畔生物科技有限公司多年来向中国客户提供了高品质的HCP、DNA、ProteinA等污染残留检测产品,以及AAE覆盖率验证,专属抗体和试剂盒开发等服务项目。上海金畔生物科技有限公司对Mock VSolutions能够加入到Cygnus Technologies品牌表示衷心的祝福,希望今后能为中国客户提供更多更好的产品和服务。为了能让更多的中国客户了解MockV的技术和产品,上海金畔生物科技有限公司邀请Cygnus高级研发总监David Cetlin (原MockV Solutions CEO)通过网络视频的形式举办线上Webinar介绍关于MVM-MVP试剂盒及相关技术原理,并且观众可以现场与David互动答疑解决对该产品和技术存在的疑问。本次线上研讨会暂定于2020年4月底(具体时间会另行通知),如有感兴趣的客户请通过上海金畔生物科技有限公司公众号报名参加。

报名方式:扫描文末下方二维码关注上海金畔生物科技有限公司微信公众号,在公众号底部菜单“客户服务”→“资料索取”中填写表单并在最后一栏中备注“MVM”,提交即可完成报名,我们会提前将参会详情通知已报名的客户。

Cygnus引进工艺中病毒残留验证产品线

Mirus新品重磅出击

转染江湖风起云涌,群雄纷争不断。近年来,病毒载体在基因/细胞治疗领域的广泛应用,让市场对病毒包装的质量和效率要求日益提升。Mirus经历两年闭关修炼,专攻AAV与Lentivirus病毒载体包装制备的新产品TransIT?-VirusGEN? Transfection Reagent终于问世,与各路转染高手过招,精彩纷呈。欲知详情,且看下文分解。

1.TransIT?-VirusGEN?招式解析
TransIT?-VirusGEN? 依然采用Mirus专利多聚物转染方法,无动物源成分,主要针对腺相关病毒(AAV)包装而研发,对部分慢病毒(Lentivirus)包装系统也有很强优势,这两种病毒都需要HEK 293细胞系生产,所以该转染试剂适用于包括悬浮和贴壁的各种类型HEK 293细胞系,能大幅提高转染效率和病毒产量,从而在有限的时间和资源里实现较大收获。

2.AAV包装实战分析
Mirus新品重磅出击
在相同培养条件下,用不同转染试剂分别在悬浮的293-F和贴壁的293T/17两种细胞系共转pAAV-hrGFP, pAAV-RC, and pAAV-Helper三种质粒包装AAV重组病毒,然后利用GFP标签在HT1080细胞上检测AAV滴度。结果显示,不论是悬浮还是贴壁293细胞系,采用TransIT?-VirusGEN?转染产出的AAV滴度远远高于其他几款转染试剂。

3.慢病毒包装实战分析
Mirus新品重磅出击
在相同培养条件下,用不同转染试剂分别在悬浮的293-F和贴壁的293T/17两种细胞系转染pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP? 穿梭质粒 和慢病毒包装质粒Mix powered(MISSION?)包装Lentivirus重组病毒,然后利用GFP标签在293T/17细胞上检测Lentivirus滴度。结果显示,不论是悬浮还是贴壁293细胞系,采用TransIT?-VirusGEN?转染产出的重组慢病毒滴度都远远高于其他几款转染试剂。

4.转染体系放大可提高AAV产量
Mirus新品重磅出击
采用TransIT?-VirusGEN?在6孔板和250mL培养瓶中转染293-F悬浮细胞系包装AAV,在6孔板和10cm平皿中转染293T/17贴壁细胞系包装AAV,两组实验在不同大小培养体系产出的重组病毒滴度比较结果显示,当体系从6孔板→250mL培养瓶(或6孔板→10cm平皿)放大后,病毒产量也会相应提升20%左右,表明该转染试剂适用于包装重组病毒的工艺放大。

产品规格
Mirus新品重磅出击
上海金畔生物科技有限公司作为Mirus中国区代理,始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供最好的产品与最优质的服务,Mirus热销产品常备现货,全国客服热线021-50837765,欢迎随时咨询订购!

逆转录病毒克隆载体-重组反转录病毒表达载体

逆转录(也成为反转录病毒,Retrovirus)病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒载体在构建时,删去了pol、env基因和gag基因的3′端,但保留了病毒颗粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高载体的安全性,防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样,反转录病毒载体就可利

Vector Names Catalog Number
pBABEhygro RTV-001-HYGRO
pBABEneo RTV-001-NEO
pBABEpuro RTV-001-PURO
pMCs-IRES-GFP RTV-040
pMCs-Puro RTV-041
pMXs RTV-010
pMXs-IRES-Blasticidin RTV-016
pMXs-IRES-GFP RTV-013
pMXs-IRES-Neo RTV-015
pMXs-IRES-Puro RTV-014
pMXs-Neo RTV-011
pMXs-Puro RTV-012
pMYs RTV-020
pMYs-IRES-GFP RTV-021
pMYs-IRES-Neo RTV-023
pMYs-IRES-Puro RTV-022
pMYs-Puro RTV-024
pMZs RTV-030

用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随机整合到宿主细胞基因组内,这种载体还在不断改进之中。

逆转录表达载体种类较多,根据其基本载体骨架分为pBABE、pMCs、pMXs、pMYx等,又有不同筛选标记,hygro(潮霉素)、neo(新霉素)、puro(嘌呤霉素)、Blasticidin(杀稻瘟素)等。很多逆转录病逆转录病毒克隆载体-重组反转录病毒表达载体毒载体包括pBABE和pMXs都是基于莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV),这种逆转录病毒载体在一些非成熟细胞里面被沉默表达,如胚胎瘤细胞、胚胎干细胞和造血干细胞,因此适应面受到限制。而骨髓瘤病毒(MPSV)和PCC4细胞来源的骨髓瘤病毒(PCMV)是MMLV的变种,能很好的在上述非成熟细胞内稳定表达。

Cell Biolabs的pMCs 、pMYs和pMZs都在MMLV启动子的基础上又加上了PCMV或MPSV启动子,后者能使逆转录病毒在EC肿瘤干细胞和ES胚胎干细胞内更稳定表达。特别的,pMYs系统更适合于造血干细胞中的外源基因表达,pMC则更适合在EC和ES细胞内使用。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒转染—ViraDuctin™逆转录病毒高效转染试剂

逆转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞,如干细胞等。由于逆转录病毒滴度较低,因此其在某些细胞里的转导效率不是很理想。在逆转录病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合,只有一小部分的逆转录病毒载体才能转导进细胞,因此,逆转录病毒颗粒的吸附是其转导的限速步骤。

在逆转录病毒的转染试验中,多聚阳离子,如聚凝胺®(Polybrene®)由于被发现能促进转染的效率被应用于逆转录病毒逆转录病毒转染—ViraDuctin™逆转录病毒高效转染试剂的转导,其作用机理可能是通过中和细胞与病毒颗粒之间的静电排斥而促进它们之间的贴附。然而在一些特殊类型的细胞里,作为逆转录病毒的转导介质,聚凝胺®(Polybrene®)的表现也不是很理想。逆转录病毒转染—ViraDuctin™逆转录病毒高效转染试剂逆转录病毒转染—ViraDuctin™逆转录病毒高效转染试剂逆转录病毒转染—ViraDuctin™逆转录病毒高效转染试剂

Cell BioLabs针对上述逆转录相关病毒转导过程中的主要问题,开发出ViraDuctin™ 逆转录病毒高效转导试剂(ViraDuctin™ Retrovirus Transduction Kit)。该试剂盒能高效提高逆转录病毒在多种细胞内的转导效率,包括传统转导方法转导较低的细胞非分裂细胞。该转导试剂使用便捷,只需2小时。与Polybrene(聚凝胺)相比,转导效率提高2-6倍,对于难转导的细胞,如原代细胞和干细胞也有非常好的效果。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
ViraDuctin™ Retrovirus Transduction Kit RV-200 40次逆转录病毒转染
RV-201 200次逆转录病毒转染

ViraDuctin™ 独有的逆转录病毒高效转导试剂,使用了Cocktail的组合试剂能有效的去除逆转录病毒上清中降低转染效率的抑制物。能有效的提高转染效率,适用于原代细胞和干细胞。该转导试剂分40和200次两种包装规格(以24孔板内一个孔为一次)。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒定量—QuickTiter™逆转录病毒快速定量试剂盒

逆转录病毒载体是常用的病毒载体之一。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内,这种整合的位点是随机的。逆转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。当通过纯化提取获得重组逆转录病毒颗粒后,需要对病毒液的浓度或感染活性进行定量检测。

一般来说,对于病毒颗粒进行定量主要是通过检测纯化的病毒液中DNA的OD260来检测其病毒含量(Quantitation);而对于病毒颗粒的滴度检测(Titer),则需要通过传统的克隆成斑试验或者对病毒特异蛋白的免疫反应试验等检测。Cell Biolabs为逆转录病毒的定量提供了QuickTiter™快速检测方案。

QuickTiter™逆转录病毒快速定量试剂盒采用了专利的捕获胶技术,能专门结合逆转录病毒颗粒,从而大大缩减试验时间,并提高定量的准确度。其定量试剂盒都能对已经纯化的和未纯化的病毒液进行检测。基本的试验大概程序如下:收集病毒上清,使用核酸酶裂解其中的DNA和RNA杂质,剩下的为病毒颗粒、蛋白及蛋白复合物,然后使用捕获胶吸附上病毒颗粒从而分离出来,洗脱下来后,对逆转录病毒颗粒变性分别获得病毒蛋白及病毒核酸,使用荧光染料标记核酸后进行定量分析。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Retrovirus Quantitation Kit VPK-120 荧光法定量,20次分析

Cell Biolabs独有的QuickTiter™ 逆转录病毒快速定量试剂盒通过检测逆转录病毒DNA含量来测定其滴度,可以快速定量已纯化或未纯化的逆转录病毒,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照腺标准曲线得出滴度。可以在45-60min内获得数据,检测灵敏,能有效检测1.5 X 109 Viral Particles (VP)/mL浓度内的逆转录病毒,可做20次。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒纯化&浓缩——ViraBind™逆转录病毒浓缩纯化试剂盒

逆转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞,如干细胞等。反转录病载体多半用于基因治疗,由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入,人们担心会引起不安全的后果,这种载体还在不断改进之中。

常规的逆转录病毒纯化一般采用超速密度离心法(利用不同大分子,如DNA、蛋白、病毒颗粒、细胞碎片等具有不同的密度进行梯度离心而分离出来的原理)分离病毒颗粒,但是耗时耗力。而且,逆转录病毒的低滴度一直是其软肋。Cell Biolabs为此研制出的拥有专利技术的ViraBind™ 逆转录病毒纯化试剂,再结合新型的纯化装置,能在4-6小时内,每次能将100ml病毒上清纯化500-1000倍,从而获得109-1010TU/ml感染滴度的逆转录病毒颗粒。采用该Kit纯化获得的逆转录病毒液,不含有游离的包装蛋白以及转导抑制物,因此非常有利于后继的逆转录病毒操作。

Cell Biolabs提供两种逆转录病毒纯化方案,一种是用纯化柱装置,另一种是PLUS的采用透析柱装置。前者纯化过程快速,只需3小时;后者采用了透析柱装置,时间上要过夜透析,但是纯度很高。具体纯化步骤及大概区别如下图所示:

逆转录病毒纯化&浓缩试剂盒(离心柱) 逆转录病毒纯化&浓缩试剂盒PLUS(透析柱)

逆转录病毒纯化&浓缩——ViraBind™逆转录病毒浓缩纯化试剂盒

逆转录病毒纯化&浓缩——ViraBind™逆转录病毒浓缩纯化试剂盒

采用专利的ViraBind™试剂,使用离心柱,只需3小时 采用专利的ViraBind™试剂,使用透析柱,需要过夜,但纯度高
   
产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
ViraBind™ Retrovirus Concentration and Purification Kit (100 ml/prep) VPK-130 每次100ml病毒液,2次离心浓缩纯化
VPK-131 每次100ml病毒液,5次离心浓缩纯化
VPK-131-5 每次100ml病毒液,25次离心浓缩纯化
产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
ViraBind™ PLUS Retrovirus Concentration and Purification Kit (50 ml/prep) VPK-135 每次50ml病毒液,2次透析浓缩纯化
ViraBind™ PLUS Retrovirus Concentration and Purification Mega Kit (500 ml/prep) VPK-136 每次500ml病毒液,2次透析浓缩纯化
VPK-136-5 每次500ml病毒液,10次透析浓缩纯化

Cell Biolabs逆转录病毒浓缩纯化试剂盒中普通纯化逆转录病毒Kit每次纯化100ml,分2次/5次/25次三种规格;PLUS纯化Kit分中提(50ml每次)和大提(500ml每次),中提包装可使用2次,大提又分为2次和10次。每次能将100ml病毒上清纯化500-1000倍,从而获得109-1010TU/ml感染滴度的逆转录病毒颗粒。采用该Kit纯化获得的逆转录病毒液,不含有游离的包装蛋白以及转导抑制物,因此非常有利于后继的逆转录病毒操作。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

逆转录病毒表达载体—Cell Biolabs重组逆转录病毒克隆载体

逆转录病毒载体是常用的病毒载体之一。转入宿主的细胞后,反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内,这种整合的位点是随机的。逆转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右,以很高的转染率感染宿主细胞,特别是分裂中的细胞。

产品名称 货号(点击查看说明书)
pBABEhygro RTV-001-HYGRO
pBABEneo RTV-001-NEO
pBABEpuro RTV-001-PURO
pMCs-GFP RTV-051
pMCs-IRES-GFP RTV-040
pMCs-Puro RTV-041
pMXs RTV-010
pMXs-IRES-Blasticidin RTV-016
pMXs-IRES-GFP RTV-013
pMXs-IRES-Neo RTV-015
pMXs-IRES-Puro RTV-014
pMXs-Neo RTV-011
pMXs-Puro RTV-012
pMYs RTV-020
pMYx-GFP RTV-052
pMYx-IRES-GFP RTV-021
pMYs-IRES-Neo RTV-023
pMYs-IRES-Puro RTV-022
pMYs-Puro RTV-024
pMZs RTV-030

逆转录病毒是一类正链RNA病毒,其分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别,并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内;同时逆转录病毒结构基因gag env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性,因此可用外源性基因代替这部分病毒基因,外源性基因较大容量为8.0kb左右,可适用于大部分目的基因;并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中,这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。

目前较常用的逆转录病毒载体为Moloney小鼠白血病病毒改建的各类逆转录病毒载体,逆转录病毒载体其他部分为细菌质粒pBR322基因,便于病毒载体体外大量扩增。Cell Biolabs提供几十种逆转录病毒表达载体。根据其根据其基本载体骨架分为pBABE、pMCs、pMXs、pMYx等;又有不同筛选标记供选择,hygro(潮霉素)、neo(新霉素)、puro(嘌呤霉素)、Blasticidin(杀稻瘟素)等。

Cell Biolabs的逆转录病毒载体pBABE和pMXs都是基于莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV),这种逆转录病毒载体在一些非成熟细胞里面被沉默表达,如胚胎瘤细胞、胚胎干细胞和造血干细胞,因此适应面受到限制。而骨髓瘤病毒(MPSV)和PCC4细胞来源的骨髓瘤病毒(PCMV)是MMLV的变种,能很好的在上述非成熟细胞内稳定表达。Cell Biolabs的pMYXs、pMYs、pMCs和pMZs都在MMLV启动子的基础上又加上了PCMV或MPSV启动子,后者能使逆转录病毒在EC和ES细胞内更稳定表达。特别的,pMYs系统更适合于造血干细胞中的外源基因表达,pMC则更适合在EC肿瘤干细胞和ES胚胎干细胞内使用。

逆转录病毒表达载体—Cell Biolabs重组逆转录病毒克隆载体

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为逆转录病毒研究人员提供完备的重组逆转录病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括逆转录病毒的最新一代表达系统,针对逆转录病毒滴度低的软肋而专门设计的逆转录病毒浓缩纯化试剂盒,逆转录病毒的快速定量,以及逆转录病毒高效转染试剂和用于包装重组逆转录病毒的包装细胞系等,几乎覆盖反转录病毒研究中的所有技术环节。如果您对上述逆转录病毒包装细胞系感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。