AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试!

AAV核酸滴度定量检测知多少

随着基因治疗技术日趋完善和临床经验不断积累,监管机构对基因治疗产品的质量控制也愈发严谨慎微。准确的滴度检测是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分,也是开展临床研究的前提条件,AAV基因治疗临床试验检测方法汇总如下表。

检测项目

检测方法

一般理化指标

外观

直接检测法

pH

电位滴定法

渗透压

渗透压测定法

纯度

蛋白含量

SDS-PAGE/银染

病毒颗粒聚集体

动态光散射

空壳率

透射电镜

OD260/OD280

分光光度计法

宿主DNA残留

qPCR

质粒DNA残留

qPCR

HKE293/BSA

ELISA

核酸酶

ELISA

性能

核酸滴度

qPCR

转染效率/感染滴度

TCID50

基因表达

ELISA

体外活性

安全性

内毒素

凝胶限度试验法

无菌

培养法

复制型AAV

培养法

其中核酸滴度检测是以AAV衣壳中所含基因组作为定量依据,测定的是含有目标基因组的AAV浓度。AAV中包含的基因组是其表达蛋白或RNA的前提,是AAV药物发挥药效的核心和基础。目前AAV核酸滴度检测方法有点杂交法、分光光度计法和qPCR法,qPCR作为第二代PCR方法,是各大研究机构和药企最广泛采用的定量方法。然而qPCR技术存在较大局限性,如检测结果只是相对标准曲线的“相对”定量,且反应容易受qPCR体系中酶或蛋白等成分的干扰,定量结果不够精准等。

ddPCR方法 vs qPCR方法

  • 数字PCR(ddPCR)被称为第三代PCR技术,与qPCR技术相比具有以下显著优势:
  • ddPCR无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量;
  • ddPCR有更高的准确度,定量CV值通常小于10%;
  • dPCR抗干扰能力更优,有实验显示,ddPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术[1]

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qPCR方法与数字PCR方法优劣势比较

另一组测试数据也显示[2],优化后的qPCR方法中位CV分别为5.35%和4.37%,较大值分别为33.2%和8.7%,而数字PCR用三个独立引物探针组的中位CV值为2%或更低,且分布更密集,可见数字PCR方法定量更加准确,重复性更高。

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从监管趋势来看,美国药典在细胞和基因治疗标准品章节中明确写道,AAV标准品定量将会使用数字PCR进行定量,可见数字PCR方法在细胞和基因治疗领域中绝对定量的突出优势。

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达普生物AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒邀请广大客户进行内部测试

综上所述,在以AAV为递送载体的基因治疗产品的定量检测中,ddPCR技术已受到越来越多业内人士的青睐,为了满足广大客户的需求,达普生物即将推出其自主研发的AAV基因组ddPCR精准定量试剂盒。上海金畔生物科技有限公司作为达普生物中国一级代理商,现携手达普生物开展“AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试活动”。

报名方法:即日起至2022年6月15日,关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号”(微信号:www.jinpanbio.cn),发送关键词“AAV定量”,填写表单,即可获得免费检测机会。每个客户限测5个样本,名额有限,先到先得!

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上海金畔生物科技有限公司作为专业服务中国生命科学领域16年的供应商,以专业和优质的服务赢得了众多客户的支持和信赖!目前已成为多家世界知名跨国企业中国区研发和生产基地、制药企业与诊断企业以及各大高校与科研院所官方采购平台的指定供应商。其中上海金畔生物科技有限公司一级代理商的达普生物科技有限公司,拥有多个自主研发的仪器平台、全球领先的生物芯片工厂和试剂体系。可广泛应用于病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选和癌症早期筛查等多个领域。

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达普生物科技有限公司由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心,拥有微流控芯片、仪器及试剂 GMP 厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域,致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产的两大技术平台:数字 PCR 系统和单细胞组学系统。产品适合应用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。

参考文献:

  1. Dobnik, David, et al.2019:1570.,Dobnik, David, et al. “Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.” Frontiers in microbiology (2019): 1570.
  2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)

慢病毒滴度测定——QuickTiter™慢病毒p24 ELISA滴度检测

慢病毒源于反转录病毒,但又有所不同。在感染能力方面比反转录病毒还强,可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、干细胞等多中类型的细胞,又很少引发基因的免疫反应。在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合持久表达、免疫反应小等优点。

美国著名细胞产品公司Cell BioLabs为慢病毒研究人员提供完备的重组慢病毒表达系统及其相关产品和服务,产品包括慢病毒的最新一代表达系统,针对慢病毒滴度低的软肋而专门设计的慢病毒浓缩纯化试剂盒,慢病毒的滴度滴定及定量,以及慢病毒高效转染试剂和慢病毒宿主细胞等,几乎覆盖慢病毒研究中的所有技术环节。

当通过纯化获得重组慢病毒颗粒后,需要对慢病毒液的浓度或感染活性进行定量检测。一般来说,对于病毒颗粒慢病毒滴度测定——QuickTiter™慢病毒p24 ELISA滴度检测进行定量主要是通过检测纯化的病毒液中DNA的OD260来检测其病毒含量(Quantitation);而对于病毒颗粒的滴度检测(Titer),则需要通过传统的克隆成斑试验或者对病毒特异蛋白的免疫反应试验等检测。Cell Biolabs为慢病毒的定量及滴度提供了全套QuickTiter™系列方案。其中涉及到通过DNA/RNA的OD值检测从而对慢病毒进行定量,详情查看“慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒”;而针对滴度检测,还提供了慢病毒外壳蛋白p24的免疫学ELISA方案。

p24蛋白是慢病毒外壳中含量较大的标志性蛋白。Cell Biolabs提供的基于慢病毒p24蛋白的ELISA分析分两种,一种称为传统的p24蛋白ELISA检测(Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA))。能检测所有p24蛋白,从而实现对病毒滴度的定量。分为一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反应灵敏,可检测1 ng/mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit (Traditional HIV p24 ELISA) VPK-108-HIV-p24 ELISA法检测,96次分析
VPK-108-HIV-p24-5 ELISA法检测,96×5次分析

由于病毒颗粒的外壳蛋白p24蛋白是由包装细胞系提供的,因此在使用检测的时候不可避免的会将病毒颗粒本身的p24蛋白与包装细胞系产生的p24蛋白一起检测,造成实验的误差,Cell Biolabs的慢病毒滴度检测Kit解决了这个问题,其QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit(Lentivirus-Associated HIV p24)能分离出包装细胞产生的游离p24蛋白,只检测病毒颗粒表面的p24,因此实验数据更真实准确。分为一次96孔板分析和五次96孔板分析,采用ELISA方法,反应灵敏,可检测1 ng /mL HIV p24蛋白,最后分光光度计读取数据。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit (Lentivirus-Associated HIV p24) VPK-107 ELISA法检测,96次分析
VPK-107-5 ELISA法检测,96×5次分析

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe™ 最新一代慢病毒表达系统有多种样式供您选择,ViraBind™ 慢病毒浓缩&纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒,QuickTiter™ 慢病毒系列提供传统和专利技术的p24不同ELISA检测方法,同时还有采用OD260方法快速定量慢病毒的方案;Cell BioLabs还有专为慢病毒载体用的293LTV细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)作为基因治疗的载体存在一些非常突出的优点,比如能感染分裂和非分裂细胞、不具有明显的致病性、整合至宿主特定染色体长期表达目的蛋白等,已成为基因治疗被广泛应用的安全、有效的载体。腺相关病毒定量——Cell Biolabs的AAV滴度滴定及定量试剂盒

在腺相关病毒的应用过程中,我们经常需要获得病毒液的病毒含量或者腺相关病毒的滴度数据。传统的方案是使用DNA点杂交或其他类似方法来测量腺相关病毒感染滴度,但是这种传统的方法实验周期较长,操作繁琐。对于已获得了高纯度AAV颗粒的检测,使用OD260nm处光吸收度数值来衡量AAV的病毒颗粒含量不失为一种更便捷的方案,遗憾的是,这种方法不适用于未纯化的病毒颗粒,因为其它的杂质会干扰260nm处的吸收度。另外,采用免疫学的办法,使用与AAV病毒颗粒结合的抗体来检测腺相关病毒含量也有被使用,但是很显然,这种方法将会检测所有AAV病毒,包括不含有基因组DNA的包装颗粒。

Cell Biolabs的QuickTiter™ AAV Quantitation Kit试剂盒(目录号:VPK-145)很好的解决了上述问题,该试剂盒包括试剂A、试剂B、捕获Matrix、洗脱液、溶液C、Dye染料以及AAV DNA标准物。本腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺病毒DNA含量来测定其病毒含量。

该腺相关病毒定量试剂盒的工作步骤是首先降解悬液里的核酸成分,然后使用Matrix胶有效结合腺相关病毒颗粒,从而分离出杂质蛋白及蛋白复合物,洗脱下AAV颗粒后进行变性,随后用染料对核酸进行染色。

由于采用了专利技术的捕获Matrix胶,不但能专一性的结合腺相关病毒颗粒,因此能有效的提高检测效度;而且可以用于未纯化的AAV病毒液,因此可定量已经纯化的AAV病毒以及未纯化的AAV病毒。经过相关步骤后,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照AAV DNA标准曲线得出AAV滴度。该试剂盒检测灵敏,对于已经纯化的AAV DNA,可以在2小时内获得数据,可检测1×109GC/ml的AAV;对于未纯化的DNA,需要使用Kit提供的提纯试剂纯化再测量,大概在3-4小时左右完成,可检出5×1010GC/ml腺相关病毒。该试剂盒能从无辅助病毒的AAV病毒液内完成20次检测。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ AAV Quantitaiton Kit VPK-145 荧光检测,20次分析

美国著名细胞学试剂专家Cell BioLabs为您提供高效简便的重组腺相关病毒相关产品和服务,产品包括腺相关病毒的纯化、定量和高效转染试剂。ViraBind™腺相关病毒纯化试剂盒采用特殊的纯化Matrix技术,无需超速离心,在大大减少试验时间的同时还保证了AAV的纯度。QuickTiter™腺相关病毒定量试剂盒通过检测腺相关病毒DNA含量来测定其病毒含量,只需2小时。ViraDuction™腺相关病毒转导试剂能极大的增加腺相关病毒在多种细胞内的转导效率,包括传统转染方法转导效率低的非分裂细胞,如原代培养细胞和干细胞。如果您对腺相关病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺相关病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺病毒定量——Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒

通过对腺病毒基因组的改造,腺病毒载体是继逆转录病毒载体后被广泛应用的转基因载体,现已发展到第三代,转染效率高,且相对制备容易。从最早的腺病毒载体出现至今,腺病毒载体的包装系统已经经历了一系列的改进。腺病毒载体已经被广泛应用于动物细胞的基因转染和基因治疗等。

在腺病毒的应用过程中,我们经常需要测量病毒液的病毒含量以及腺病毒滴度。目前实验里做腺病毒常规滴度检腺病毒定量——Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒测有通过TCID50或者空斑计数法(PFU)测量腺病毒感染滴度的方法,但是这种传统的方法实验周期较长,操作繁琐。如常规PFU的检测就就需要10天左右的时间。Cell BioLabs的QuickTiter™腺病毒功能滴定试剂盒,采用免疫蛋白反应的原理检测腺病毒标志性外壳蛋白——Hexon的表达含量,从而得到腺病毒液的功能滴度,只需2天多的时间就能获得比常规实验所需要10天的测量结果还要准确的数据。但是即使是这样的方法,也需耗时2天,一般说来,如果已经获得了纯化的病毒液,通过测量OD260来估算病毒颗粒的总含量不失为一种快捷的多的腺病毒定量方案。

上海金畔生物科技有限公司针对腺病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Adenovirus Rapid Quantitation Kit(目录号:VPK-106)。该试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核算分子降解,然后用特异性的腺病毒捕获珠子结合腺病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下腺病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照腺病毒DNA标准曲线得出腺病毒滴度。

Cell BioLabs腺病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、腺病毒捕获液、Dye染料以及腺病毒DNA标准物。该试剂盒不仅能直接用于已纯化的病毒悬液,对于未纯化的腺病毒,该试剂提供快速纯化试剂,您可以在纯化前通过该kit测算出病毒悬液上清中的腺病毒含量,也可以使用该Kit内的纯化试剂先进行纯化步骤。整个腺病毒定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据,检测灵敏。

另外,该定量试剂盒不仅能应用于腺病毒,由于是通过OD260测量核酸含量从而通过与标准曲线的比对得出腺病毒的含量,因此还能应用于其他的病毒定量。如反转录病毒,慢病毒等。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Adenovirus Quantitation Kit VPK-106 荧光检测,20次测定

Cell BioLabs为您提供全套的腺病毒技术解决方案,RAPAD®腺病毒表达系统有多种样式供您选择,还有预装有多种重组基因的腺病毒供您直接使用,ViraBind™腺病毒小提及中提大提试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的腺病毒,Cell BioLabs还有转为腺病毒载体用的293AD细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对腺病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

腺病毒滴度测定——Cell BioLabs腺病毒功能滴定试剂盒

1953年,Rowe等首次由人的手术切除的扁桃体组织,用血浆埋块培养分离得到一株病毒,得名腺病毒。该病毒是无囊膜的线性双链DNA病毒,腺病毒在自然界分布广泛。通过对腺病毒基因组的改造。腺病毒载体是继逆转录病毒载体后被广泛应用的转基因载体,现已发展到第三代,转染效率高,且相对制备容易。从最早的腺病毒载体出现至今,腺病毒载体的包装系统已经经历了一系列的改进。腺病毒载体已经被广泛应用于动物细胞的基因转染和基因治疗等。

在腺病毒的试验中,我们经常需要测量病毒液的病毒含量以及腺病毒滴度。目前实验里做腺病毒常规滴度检测有通过TCID50或者空斑计数法(PFU)测量腺病毒感染滴度的方法,用纯化的腺病毒通过OD260推算出的腺病毒颗粒滴度的方法等等。但是这种传统的方法,实验周期较长,如常规PFU的检测就就需要10天左右的时间,而通过OD值方案也只是推算,和腺病毒真实的活力滴度还是有一定的误差。

上海金畔生物科技有限公司针对腺病毒滴度测定实验为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Adenovirus Functional Titer Kits,该Kit摒弃了传统的空斑形成试验,采用免疫蛋白反应的原理检测腺病毒标志性外壳蛋白——Hexon的表达含量,从而得到腺病毒液的功能滴度。该腺病毒滴度测定试剂盒适用性很广,可用于所有41类血清型的腺病毒。

腺病毒滴度测定——Cell BioLabs腺病毒功能滴定试剂盒

由于采用了ELISA的方法,滴定实验的时间大大缩短,同时比传统的PFU法滴定结果更为准确,实验操作上也更为快捷,只需2天多的时间就能获得比常规实验所需要10天的测量结果还要准确的数据;另外,由于不需要进行空斑形成实验,无需繁复的琼脂铺层步骤,因此也很便于实验室操作,大大方便了腺病毒使用的科研工作者。 

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Adenovirus Titer Immunoassay Kit VPK-109 免疫印迹法检测,100次测定
QuickTiter™ Adenovirus Titer ELISA Kit VPK-110 ELISA法检测,2×96次测定

该腺病毒滴度测定试剂盒内包括hexon一抗、HRP酶联二抗、TMB/DAB底物、终止液及ad-b gal阳性对照;您也可以根据您实验的要求,选择ELISA Kit或者Immunoassay Kit其中的一种。

Cell BioLabs为您提供全套的腺病毒技术解决方案,RAPAD®腺病毒表达系统有多种样式供您选择,还有预装有多种重组基因的腺病毒供您直接使用,ViraBind™腺病毒小提及中提大提试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的腺病毒,Cell BioLabs还有转为腺病毒载体用的293AD细胞及高效转染试剂供您选择,如果您对腺病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询腺病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。