间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发


间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

外泌体再生医学的实现之路

间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所

丸谷祐树、山根昌之

◆前言

细胞外囊泡(Extracellular vesicle : EV)是由细胞释放的脂质双分子层包被的膜囊泡,作为细胞间的通讯工具发挥作用。外泌体属于EV的一种,被认为参与多种生物功能的控制,并有望用作疾病生物标记物或治疗制剂。在治疗制剂的应用方面,具有抗炎和抗纤维化作用的间充质干细胞(Mesenchymal stem cell:MSC)来源外泌体备受瞩目,其未来的实用性被寄予厚望。对MSC来源外泌体实际应用的期望不断提升,同时外泌体作为治疗制剂的生产技术研发也在积极进行。

本文将介绍由FUJIFILM Wako自主研发的无血清培养基,在生产用于治疗的MSC来源外泌体方面的实用性。

 

◆MSC来源外泌体

以CD9、CD63和CD81等作为标记蛋白的外泌体,由细胞释放的、直径在30-100 nm左右的脂质双分子层包被的膜囊泡,含有蛋白、核酸(DNA、mRNA、miRNA)、脂质等细胞来源成分1,2)。另外,MSC来源于中胚层的成体干细胞,能够从骨髓、脂肪、脐带等组织中建立,具有分化为脂肪、骨骼和软骨的功能。除此之外,MSC还具有诱导抗炎、抗纤维化或免疫抑制等旁分泌效应,近年来有人提出这些作用是由外泌体引起的3)。在此背景下,将MSC来源外泌体作为治疗制剂的关注度急剧攀升。

 


◆MSC来源外泌体产生用无血清培养基的研发背景

关于在产生MSC来源外泌体时所用的培养基,起初使用的是几种添加了不含牛来源外泌体的胎牛血清(EV-depleted FBS)的基础培养基4,5)。然而,这些组分均以维持MSC存活为目的,能够优化外泌体分泌和生物活性效果的组分尚未研发成功。

为此我们研发了一款可为MSC产生外泌体提供适宜的环境的无血清、无动物培养基,即为可同时维持高性能和高生物活性的EV-Up™基础培养基及补充剂(下称EV-Up™培养基)。

 


◆使用EV-Up™培养基培养获得的外泌体产量及活性

EV-Up™培养基的推荐使用方法是,在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合,然后更换培养基并培养 3-5 天(图1)。从血清培养基更换为无血清培养基时,多数情况下都需要进行驯化操作,但在含FBS的血清培养基中增殖的细胞,也能够直接更换EV-Up™培养基培养。

间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

图1. EV-Up™培养基的建议操作流程

           在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合后,更换至EV-Up™培养基。然后培养 3-5 天,回收培养上清。可以通过PS亲和法从回收的培养上清液中回收外泌体。

 


在血清培养基中使骨髓来源的MSC增殖,然后更换至含EV-depleted FBS的基础培养基或EV-Up™培养基中,检测培养5天后的细胞数和细胞生存率。结果显示,细胞数和细胞生存率均维持在较高的状态下(图2 – A、B)。

间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

图2. 使用EV-Up™培养基培养MSC的细胞生存率

更换至EV-Up™培养基5天后,测得的细胞数(A)和细胞生存率(B)。

 


接着,利用纳米粒子追踪分析法(NTA)比较使用PS亲和法纯化的外泌体粒子数6)。结果表明,使用EV-Up™培养基获得的外泌体,其粒子数约为使用含EV-depleted FBS的基础培养基的2.6倍(图3A)。进一步通过基于PS亲和法外泌体定量技术的PS ELISA比较外泌体产量,可确认和粒子数一样,外泌体标记蛋白CD9、CD63 和CD81都有所增加6,7)(图3 B)。

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图3. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体粒子数及外泌体标记蛋白

从各培养基中取培养上清1 mL,通过NTA比较获得的外泌体粒子数(A)以及通过PS ELISA分析外泌体标记的结果(B)。

最后,评估对人胎肺来源正常成纤维细胞(TIG3)的纤维化抑制效果,以比较在各培养基中培养的MSC来源外泌体的生物活性。结果表明,相比常规使用的基础培养基和含EV-depleted FBS的培养基,采用EV-Up™培养基培养的MSC来源外泌体具有更好的抗纤维化效果(图4)。

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图4. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体生物活性(抗纤维化活性)

向TGFβ刺激的人胎儿肺源性成纤维细胞(TIG3细胞)中添加PS亲和法纯化的外泌体5×108 particles/mL,

利用Real-Time PCR法定量纤维化标记(αSMA,Collagen Ⅲ)的基因表达,比较抗纤维化活性。           

 


以上结果显示,EV-Up™培养基可以高产量制备维持高生物活性的MSC来源外泌体,是一款创新性的培养基。

 

◆结语

此次我们研发的EV-Up ™培养基是针对MSC优化的无血清、无动物来源的外泌体生产用培养基,不仅能提升高活性外泌体的产量,因其无血清、非动物源,还可能有助于提高治疗制剂开发过程中的质量稳定性。今后使用外泌体作为治疗制剂的应用化将会在世界范围内不断发展,期待我们研发的培养基作为实用的生产技术工具得到广泛运用。

〔参考文献〕


1) Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255(2014).

2) Mathieu, M. et al. : Nat. Cell Biol., 21(1), 9(2019).

3) Phinney, D. G. and Pittenger, M. F. : Stem Cells, 35(4), 851(2017).

4) Rajendran, R. L. et al. : Sci. Rep., 7(1), 15560(2017).

5) Lai, R. C. et al. : Stem Cell Res ., 4(3), 214(2010).

6) Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935(2016).

7) Ma, Y. et al. : Sci. Rep., 11(1), 13471(2021).

◆相关产品

产品编号

产品名称

等级

包装

053-09451

EV-Up™ EV Production Basal Medium for MSC, AF
EV-Up™ 间充质干细胞外泌体生产用基础培养基,无动物源成分

细胞培养用

95 mL

298-84001

EV-Up™ MSC EV Production Supplement, AF
EV-Up™ 间充质干细胞外泌体生产用添加剂,无动物源成分

细胞培养用

5 mL(100 mL用)

294-84101

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2
MagCapture™外泌体提取试剂盒PS Ver.2

基因研究用

2 tests

290-84103

基因研究用

10 tests

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MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS Ver.2

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这里小编为大家推荐一种非常简单但高效,仅需三个步骤就能将hPSCs分化为成熟骨骼肌细胞的新方法——来自Myocea公司的Skeletal Muscle Differentiation Kit(hPSC诱导分化骨骼肌试剂盒)。该方法的优点是仅需要单层细胞培养就可以制备出大量的SkMCs,而无需表达肌原性转录因子或细胞分选等额外操作。由于成肌祖细胞和成肌细胞具有很高的增殖能力,可以通过常规传代方式进行大规模扩增,从而获得大量分化的肌管细胞。因此,该方法非常简单高效,并且适用于自动化和大规模生产。实验表明,仅用6×104个hPSCs就可以生产出7.5×107个SkMCs,说明了该方法具有很高的效率和可扩展性。

新品| hPSC诱导分化骨骼肌试剂盒Skeletal Muscle Differentiation Kit

Myocea的Skeletal Muscle Differentiation Kit是世界首款能将hPSCs分化为骨骼肌细胞的商品化培养基系统,由四个培养基组成。通常情况下,从人多能干细胞生成肌细胞需要3个阶段(如上图),即依次生成卫星样祖细胞(satelite-like progenitor cells)和成肌细胞(myoblasts),最后融合成为多核肌管细胞(multinucleated myotubes)。因此Skeletal Muscle Differentiation Kit包含了三个分化阶段所需的三种培养基,此外它还提供了一个促进肌管融合的培养基作为可选组分,可根据研究者希望得到的细胞表型灵活选择。骨骼肌分化系统的四个培养基详情见下表。

货号

品名

SKM01-250mL

Skeletal Muscle Induction Medium (Stage I)

SKM02-250mL

Skeletal Myoblast Medium (Stage II)

SKM03-250mL

Myotube Medium (Stage III, Option 1)

SKM03+-250mL

Myotube Fusion Medium (Stage III, Option 2)

用该培养系统分化生成的肌细胞通常由70-90%的肌管细胞和10-25%的肌前体细胞组成。如下图细胞标志物染色显示肌细胞表型成熟且功能完整。

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更重要的一点是,通过标志物的核酸与蛋白表达水平的比对发现,该方法具有很高的可重复性,几株不同的干细胞系分化实验比对显示组间差异很小,稳定性非常好。因此,Skeletal Muscle Differentiation Kit还适用于高通量筛选和药物开发。

综上所述,Skeletal Muscle Differentiation Kit包括了以下优势特点,确实是一个令人心动的骨骼肌分化方案。

  • 肌细胞生成率高。
  • 三步法操作简单,无需细胞分选,无需表达肌原性转录因子。
  • 实现了成肌细胞的扩增和储存,从而建立可再生的肌细胞库。
  • 方法稳定,重复性好。

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Myocea, Inc.是一家专注于提供神经肌肉疾病领域产品与服务的公司,是能够为相关制药企业提供专业试剂与合同服务的学术型战略合作者。Myocea公司是目前世界上拥有较大的人类胚胎干细胞的细胞库之一,并已开发和推出了世界首款稳定、高效且可扩展的专业骨骼肌细胞分化培养基系统。

上海金畔生物科技有限公司是Myocea品牌的中国区一级代理商,为用户提供完善的技术支持与售后服务。如对以上产品感兴趣,欢迎拨打上海金畔生物科技有限公司客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多信息。

参考文献:

A Human Pluripotent Stem Cell Model of Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy-Affected Skeletal Muscles. Stem Cells Transl Med. 2016 Sep;5(9):1145-61.

干细胞培养专用血清

SC-Sure™ Fetal Bovine Serum (FBS)
ESC-SureTM Fetal Bovine Serum (FBS)是美国Applied StemCell提供的干细胞专用胎牛血清,由澳大利亚优等胎牛血清经严格筛选而来,开瓶即用。该血清除了例行正常的生化和病原体检测外,还增加了小鼠胚胎干细胞培养和遗传测试,确保每批血清都可以支持胚胎干细胞正常的细胞形态、核型以及遗传稳定性等,是市场上一款经过小鼠胚胎干细胞遗传种系传递测试的产品。
产品特色

  1. 经遗传种系传递测试;
  2. 开瓶即用,无需热灭活;
  3. 无毒、无病毒、无支原体;
  4. 超低价格;
  5. 现货供应。

干细胞培养专用血清 

产品信息

品名

货号

规格

ESC-Sure™ Fetal Bovine serum, Germline transmission tested

ASM-5006

100ml

ASM-5007

500ml

上海金畔生物科技有限公司是美国应用干细胞有限公司(Applied StemCell, ASC)中国一级代理商,专业提供干细胞研究所需干细胞培养基、血清、细胞因子以及Knock-in/Knock-out转基因小鼠服务。

101 Bio最新细胞示踪标记物Long-term Cell Tracer

美国101bio厂家新研发产品Long-term Cell Tracer 580 是一种长时效细胞示踪剂,广泛应用于癌细胞、骨髓间充质干细胞、外周血单核细胞、内皮祖细胞、人/小鼠间充质干细胞、皮肤干细胞等细胞中;它是一类具有和无机量子点相似大小和光稳定性的有机荧光点,能够克服无机量子点的潜在毒性、在有活性氧时荧光受到影响等方面在高级生物成像中的应用限制。在体内或者体外细胞示踪应用方面,它与细胞穿透肽结合后,能够表现出比无机量子点细胞标记试剂盒更出色的标记能力。干细胞研究表明:细胞示踪剂在间充质干细胞分化过程中不会产生负作用。这些优势使它有可能替代量子点探针在转化研究应用中的发挥重要作用。

产品特点:

  1. 长期的光稳定性——在体内达3周
  2. 高亮度——信噪比高
  3. 不同的颜色——蓝色,绿色,黄色,红色
  4. 低毒性——不含重金属元素
  5. 生物相容性好且可定制性——能够与不同的生物分子结合
  6. 易使用性——仅含一个组分

不同的颜色可以同时用于不同细胞组分的示踪,更多颜色产品等待上架中。

产品参数:

规    格:1 mL, 200 nM

光稳定性:体外为12代,体内为3周

运输温度:常温

保存温度:4℃保存(可以冻存但避免反复冻融)

保 质 期:室温为一个月,4℃保存一年

产品信息:

货号

品名

用途

规格

P710Y

Long-term Cell Tracer 580(Yellow)

细胞示踪剂

1 mL, 200 nM

Table 1. Cell Tracer outperforms other QDs in terms of long term tracing

Day 1

Day 3

Day 5

Day 7

Cell Tracer

99.4%

98.2%

82.2%

31.1%

Other QDs

84.1%

43.9%

26.9%

4.3%

Table 1 summarizes the fluorescence intensity of the labeled cells at different time point from flow cytometry data in Fig. 1. These data show that Cell Tracer last much longer in labeled cells than other QDs.

Table 2. Comparison of Cell Tracer and other QDs

工作浓度

低毒性

对干细胞的副作用

可定制性

跟踪持续性

Cell Tracer

0.1 – 2 nM

可忽略的

9-12

Other QDs

2 – 15 nM

×

有副作用的报道

×

5-6 代

Cell Tracer has advantage over other QDs in many aspects including working concentration, toxicity and flexibility etc.

101 Bio最新细胞示踪标记物Long-term Cell Tracer

使用方法:

Long-term Cell Tracer 580(Yellow)的最佳工作浓度为0.1 nM ~ 4 nM,可推荐根据细胞类型和实际应用调整最佳工作浓度,以下以2 nM本产品为例:

使用前准备:

10 μL Long-term Cell Tracer 580加入到1ml细胞培养基中,混匀30s,配成细胞标记培养基(推荐现用现配)。

标记贴壁细胞:(以6孔板为例)

1.  将贴壁细胞平铺到培养皿上,当达到80%融合状态时,用PBS洗两次;

2.  将1ml准备好的标记培养基加到6孔板中,37℃孵育4h或过夜;

3.  PBS洗两次;

4.  细胞可用于其他分析。

标记非贴壁细胞

  1. 1500 rpm 离心 5 min收集细胞,弃去培养基;
  2. 加入标记培养基使细胞悬浮(1×106 / 3 mL培养基);
  3. 37℃孵育4h;
  4. 1500 rpm 离心 5 min收集细胞,用PBS洗两次;
  5. 细胞可用于其他分析。

更多产品信息欢迎咨询101Bio中国一级代理商—上海金畔生物科技有限公司,全国免费客服热线021-50837765