通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测


通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

筑波大学生 命环境系1)、北海道大学 医学研究院 微生物学免疫学领域2) 

浦山俊一1)、福原崇介2)

◆前言

人类发现病毒的存在大约是在1900年,其契机是动植物间出现的一种原因不明的传染病。在寻找致病病原体的过程中,由于它比当时已知的最小病原体(微生物)更小,且具有异质性,因此被命名为"病毒"。此后,研究人员在所有生物体内都发现了各种不同类型的病毒,现在病毒被认为是细胞生物体内普遍存在的绝对寄生因子。

RNA病毒是以RNA为基因组的病毒的总称,从狭义上讲,是指去除在其生命周期内同时利用DNA的逆转录病毒(例如HIV的基因组是RNA,但它能经过逆转录进入宿主的基因组DNA中)的病毒群。它包含多种对人类,家畜和植物等经济型生物有重大危害的病毒,例如典型的SARS-CoV-2、流感病毒、寨卡病毒和丙型肝炎病毒。

对于肉眼无法看见且难以培养的RNA病毒,”发现”其存在至关重要。不仅是医疗领域,还需要更进一步展开关于这些RNA病毒的起源和传播的全健康(one health)研究,并从包含RNA病毒的全球生态系统的角度对其进行认识。因此,基于各种目的的RNA病毒检测方法也应运而生,本文将基于"双链RNA"的方法介绍其应用于高等动物组织的案例。

 

◆利用双链RNA检测RNA病毒的原理

不携带RNA病毒的细胞几乎不存在长双链RNA。但是,存在RNA病毒时,RNA病毒基因组的复制过程中会产生双链RNA,因此,如果在生物样品中检测出双链RNA,则表明存在RNA病毒1,此处的关键在于双链RNA的纯化技术。纯化主要使用的是利用双链RNA结合于纤维素树脂的性质的柱色谱法1-3,和使用双链RNA结合蛋白和抗双链RNA抗体的方法,以及通过DNA和单链RNA的分解留下双链RNA的方法。通过解码得到的双链RNA,也可以选择性地确定RNA病毒基因组4-8

 

◆动物组织中的双链RNA的纯化和解码

由于几乎没有从高等动物样品纯化双链RNA的报告,因此我们首先使用被广泛使用的纤维素树脂进行纯化。使用市售肉糜的测试结果表明,rRNA的读数比例的约占90%,通过分子内互补结合,残留了大量具有部分双链RNA结构的rRNA(图1左)。相同的方法应用于真菌、植物、昆虫时,rRNA读数比例仅为百分之几,这表明这是高等动物样品特有的课题。因此,将使用相同方法纯化的双链RNA溶液进一步用市售的rRNA去除试剂盒进行处理,可将rRNA读数比例减少到20%左右(图1右)。

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

图1. 肉糜样品中,普通的双链RNA纯化会残留大量rRNA

使用自制核酸纯化柱通过纤维素树脂从肉糜样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果,将获得的双链RNA组分进行分组,准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品,分别通过FLDS法9)进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例。

但是,使用rRNA去除试剂盒会使每个样品的成本增加1万日元左右,处理过程也会变得繁琐且耗时。因此,使用ISOVIRUS Ⅱ(使用纤维素树脂纯化双链RNA用试剂盒, ISOVIRUS的动物样品版)对人肝脏样品进行测试。结果表明,使用ISOVIRUS Ⅱ时,即使不经过rRNA去除工序,也可将rRNA读数比例抑制在20%左右(图2A左)。当ISOVIRUS Ⅱ与rRNA去除试剂盒配合使用时,可进一步降低rRNA读数比例至10%以下(图2A右)。并且,该样品来源为HCV阳性患者,因此也能检测出HCV读数(图2B)。

通过高等动物的双链RNA纯化技术实现对RNA病毒的高效综合检测

图2. ISOVIRUS Ⅱ的rRNA残留量少

使用ISOVIRUS Ⅱ通过纤维素树脂从人肝脏样品中纯化双链RNA。为了阐明rRNA的去除效果,将获得的双链RNA组分进行分组,准备已去除rRNA的样品和未去除rRNA的样品,分别通过Modified dsRNA-seq法4)进行测序。通过SortMeRNA软件计算rRNA在清理后的数据中所占的比例,并通过绘图计算HCV的比例。

◆结语

双链RNA作为RNA病毒感染的分子标志物,近50年来一直为提高RNA病毒的探索效率做出贡献。实际上,笔者以前报告的Modified dsRNA-seq方法已成功捕获以极低复制率潜藏在人体器官中的HCV。与采用一般的RNA病毒探索方法相比,检测灵敏度高数百倍,且无需花费巨额测序成本就能全面检测RNA病毒。

直到最近,双链RNA纯化还没有试剂盒化,而是作为每个研究室传承的特殊技术。但是,随着ISOVIRUS系列的推出,它成为了人人都能使用的技术。并且,ISOVIRUS Ⅱ还有望消除昂贵且繁琐的rRNA去除工序,大幅降低从高等动物样品中探索RNA病毒的成本。

在RNA疫苗的生产中,需要去除作为副产物产生的双链RNA,以避免不必要的自然免疫激活10)。ISOVIRUS系列能够稳定地回收可能仅微量存在的HCV来源双链RNA,并且具有数百ng量级的高结合容量,还有望用于上述RNA疫苗的生产。

◆参考文献

 1. Morris, T. J. and Dodds, J. A. : Phytopathology69, 854 (1979).

 2. Marquez, L. M. et al. : Science315, 513 (2007).

 3. Okada, R. et al. : J. Gen. Plant Pathol., 81, 103 (2015).

 4. Izumi, T. et al. : Viruses13, 1310 (2021).

 5. Hirai, M. et al. : Microbes Environ., 36, ME20152 (2021).

 6. Roossinck, M. J. et al. : Mol. Ecol., 19 Suppl 1, 81 (2010).

 7. Decker, C. J. et al. : Viruses11, 943 (2019).

 8. Yanagisawa, H. et al. : Viruses8, 70 (2016).

 9. Urayama, S. et al. : Mol. Ecol. Resour., 18, 1444 (2018).

10. Rosa, S. S. et al. : Vaccine39, 2190 (2021).

◆注释

双链RNA

两个具有互补序列的RNA分子形成碱基对,具有双螺旋结构的RNA分子。

读数(比例)

指通过新一代测序技术获得的庞大数量的碱基序列之一。在庞大的读数中,表示特定序列所占的百分比时,称为"读数比例"。

HCV

丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus)的简称。多数的慢性感染患者被认为会发展成肝硬化或肝癌。

◆相关产品

双链RNA纯化试剂盒

产品编号

产品名称

产品规格

310-08811

ISOVIRUS

20次用

312-09091

ISOVIRUS II

20次用

美国MP土壤基因组DNA提取试剂盒 实验室耗材6560200

美国MP土壤基因组DNA提取试剂盒 实验室耗材

简要描述:

美国MP土壤基因组DNA提取试剂盒用于从土壤中的所有生物包括 G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫类甚至真细菌的孢子、芽孢中提取基因组 DNA。而且它还可以提取其他环境样品的 DNA,如沉积物、排泄物、废水、雪水等。只需 500mg的样品即可得到足够的 DNA。

英文名: FastDNA Spin Kit for Soil
保质期: 长期
规格: 50T
从土壤样品中提取基因组 DNA
FastDNA Spin Kit for Soil ( MP bio土壤基因组 DNA提取试剂盒)
FastDNA Spin Kit for Soil (土壤基因组 DNA提取试剂盒)用于从土壤中的所有生物包括 G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫类甚至真细菌的孢子、芽孢中提取基因组 DNA。而且它还可以提取其他环境样品的 DNA,如沉积物、排泄物、废水、雪水等。只需 500mg的样品即可得到足够的 DNA。实验原理为用特殊的裂解介质 E处理样品,之后使用自旋过滤器基于硅吸附 DNA原理的 GENECLEAN步骤进行纯化,得到的 DNA可用于 PCR、限制性酶切、电泳及其他下游实验。
产品应用: 从土壤或其它环境样品的生物体中分离 DNA,所获得的 DNA可用于 PCR、电泳、酶切和其它实验。
保存条件: 试剂盒置于室温( 15-30℃)条件下保存。
实例: 下图的基因组 DNA使用 FastDNA Spin Kit for Soil提取获得。
土壤样品来自: 番茄盆栽;淤泥;砂土;松树下;棕榈树下;绿色花园;马蹄莲盆栽;草坪;柑橘树和鳄梨树等 
产品特性与优点
配合 FastPrep仪器裂解样品处理更快、重复性更好、产量更高;
适用于从不同类型土壤的微生物和动植物组织中分离基因组 DNA;
对不同来源的样品,都可以在 60min内裂解分离 DNA,配合 FastPrep仪器只需 30min;
不含有毒有害的试剂成分。 

美国MP土壤基因组DNA提取试剂盒

订货信息:

货号           品名                                 规格

6560200 FastDNA SPIN kit for Soil 50prep