AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试!

AAV核酸滴度定量检测知多少

随着基因治疗技术日趋完善和临床经验不断积累,监管机构对基因治疗产品的质量控制也愈发严谨慎微。准确的滴度检测是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分,也是开展临床研究的前提条件,AAV基因治疗临床试验检测方法汇总如下表。

检测项目

检测方法

一般理化指标

外观

直接检测法

pH

电位滴定法

渗透压

渗透压测定法

纯度

蛋白含量

SDS-PAGE/银染

病毒颗粒聚集体

动态光散射

空壳率

透射电镜

OD260/OD280

分光光度计法

宿主DNA残留

qPCR

质粒DNA残留

qPCR

HKE293/BSA

ELISA

核酸酶

ELISA

性能

核酸滴度

qPCR

转染效率/感染滴度

TCID50

基因表达

ELISA

体外活性

安全性

内毒素

凝胶限度试验法

无菌

培养法

复制型AAV

培养法

其中核酸滴度检测是以AAV衣壳中所含基因组作为定量依据,测定的是含有目标基因组的AAV浓度。AAV中包含的基因组是其表达蛋白或RNA的前提,是AAV药物发挥药效的核心和基础。目前AAV核酸滴度检测方法有点杂交法、分光光度计法和qPCR法,qPCR作为第二代PCR方法,是各大研究机构和药企最广泛采用的定量方法。然而qPCR技术存在较大局限性,如检测结果只是相对标准曲线的“相对”定量,且反应容易受qPCR体系中酶或蛋白等成分的干扰,定量结果不够精准等。

ddPCR方法 vs qPCR方法

  • 数字PCR(ddPCR)被称为第三代PCR技术,与qPCR技术相比具有以下显著优势:
  • ddPCR无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量;
  • ddPCR有更高的准确度,定量CV值通常小于10%;
  • dPCR抗干扰能力更优,有实验显示,ddPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术[1]

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qPCR方法与数字PCR方法优劣势比较

另一组测试数据也显示[2],优化后的qPCR方法中位CV分别为5.35%和4.37%,较大值分别为33.2%和8.7%,而数字PCR用三个独立引物探针组的中位CV值为2%或更低,且分布更密集,可见数字PCR方法定量更加准确,重复性更高。

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从监管趋势来看,美国药典在细胞和基因治疗标准品章节中明确写道,AAV标准品定量将会使用数字PCR进行定量,可见数字PCR方法在细胞和基因治疗领域中绝对定量的突出优势。

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达普生物AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒邀请广大客户进行内部测试

综上所述,在以AAV为递送载体的基因治疗产品的定量检测中,ddPCR技术已受到越来越多业内人士的青睐,为了满足广大客户的需求,达普生物即将推出其自主研发的AAV基因组ddPCR精准定量试剂盒。上海金畔生物科技有限公司作为达普生物中国一级代理商,现携手达普生物开展“AAV核酸滴度数字PCR定量试剂盒免费测试活动”。

报名方法:即日起至2022年6月15日,关注“上海金畔生物科技有限公司微信公众号”(微信号:www.jinpanbio.cn),发送关键词“AAV定量”,填写表单,即可获得免费检测机会。每个客户限测5个样本,名额有限,先到先得!

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上海金畔生物科技有限公司作为专业服务中国生命科学领域16年的供应商,以专业和优质的服务赢得了众多客户的支持和信赖!目前已成为多家世界知名跨国企业中国区研发和生产基地、制药企业与诊断企业以及各大高校与科研院所官方采购平台的指定供应商。其中上海金畔生物科技有限公司一级代理商的达普生物科技有限公司,拥有多个自主研发的仪器平台、全球领先的生物芯片工厂和试剂体系。可广泛应用于病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选和癌症早期筛查等多个领域。

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达普生物科技有限公司由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心,拥有微流控芯片、仪器及试剂 GMP 厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域,致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产的两大技术平台:数字 PCR 系统和单细胞组学系统。产品适合应用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。

参考文献:

  1. Dobnik, David, et al.2019:1570.,Dobnik, David, et al. “Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.” Frontiers in microbiology (2019): 1570.
  2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)

慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不慢病毒定量——Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞,也可感染非分裂细胞,如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等,还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点,是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中,由于加入了GFP标记蛋白,因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便,且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示,首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解,然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒,从而分离出蛋白核酸复合物,洗脱下慢病毒后进一步降解,然后标记其病毒核酸,通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据,对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液,定量步骤快捷,可以在45-60min内获得数据。检测灵敏,可以从100ul慢病毒上清中检测出1010VP/ml的慢病毒,足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

产品名称 货号 产品说明(点击查看说明书)
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit VPK-112 荧光法检测,20次分析

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案,ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择;多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案;ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒,解决了慢病毒低滴度的软肋;Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择,如果您对慢病毒产品感兴趣,请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案,或索取最新的Cell BioLabs产品资料。