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球体·类器官共培养的范式转移

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球体·类器官共培养的范式转移

球体·类器官共培养的范式转移




Ginreilab Inc. 岛崎猛夫

◆前言

细胞培养方法种类繁多，例如，在培养皿上培养细胞，并集中分析同种细胞的单层静置培养法；通过搅拌培养基使细胞保持在悬浮状态进行培养的悬浮培养法；使用凝胶状基质进行培养的培养法等等。这些培养技术犹存已久，1962年，Boyden等人开发了细胞迁移分析法1），后被用于通过被称为细胞培养插件的培养基进行非接触式共培养法。1971年，立体培养细胞群开始有了“球体”2）的说法。

球体是指细胞通过相互粘附形成的简单集合体，并构建成三维结构的状态。顾名思义，「球（sphere）+oid」即指球状物体。一般而言，细胞会通过支架粘附于容器，若没有支架，或支架较弱时，就会相互粘附形成三维立体的结构。球体培养制备正是利用这一特点，不制作支架的方法。例如，使用非粘附性容器的制备方法；通过工学的微细加工技术使用结构体的方法；一边旋转培养器一边进行培养的旋转培养法；在液滴中进行立体构建的悬滴法等等3）。

关于进行共培养或球体培养的理由，若能让细胞与细胞间进行直接或是间接交流（相互作用），就能阐明细胞是否发挥了单个细胞无法发挥的功能。

球体与下述的类器官，虽然经常使用相同意思来表达，但球体的功能性并不如类器官发达，严格来说，两者间有着明显的区别。

类器官「器官（organ）+oid」，即指类似于器官的物体。一般而言，它指三维培养干细胞所得的组织。最近，由干细胞分化而成的不同种类的分化细胞，以及原分化细胞混合制备而成的立体细胞群也被称为类器官。因此，无论原始细胞是否皆为干细胞，均可广义地描述为“利用细胞技术人为制造与器官类似的组织”。生物学上类器官是指 “使用干细胞或有助于器官形成的前体细胞等，通过药物和环境构建等方法人为模拟胚胎学中的生物学过程，具有自律性形成的器官样集合体”。各项研究表明，类器官可详细再现人类器官的结构和生理功能，能够用于阐明病理和药物开发。为顺应临床测试周期的缩减以及动物实验替代的趋势，类器官的研究盛行。以生物学研究为基础，结合被称为organ-on-a-chip的工学技术进行培养和分析的研究盛行，总称为仿生系统（microphysiological systems：MPS）。美国环境部提出2025年将动物实验减少30%，2035年完全消除动物实验的计划。2023年1月6日，美国FDA颁布了临床试验前无需进行动物实验，可采用使用细胞技术实验结果的法案4）。虽然颁布的法案与预期相符，但依然让人震惊。某种意义上，两者间的关系正如“动物实验=汽油车”，“细胞技术和类器官=电动车”。换言之，未来使用细胞技术的新药研究将会成为主流，球体培养、Organ-on-a-chip 、MPS技术则会成为范式转移的关键技术。

为使水平链接细胞共培养板UniWells5）向Organ-on-a-chip/MPS系统进化，我们进行了开发。作为初级阶段的技术介绍，笔者将介绍水平方向连接的优点，以及运用其优点进行的球体和类器官的共培养。

1）UniWells水平方向连接的优点

作为共培养容器被广泛使用的插入式细胞培养板，原本是Boyden等人为了检测细胞移动能与浸润能而开发，被称为Boyden chamber1）。其结构为两个桶状容器交叠，上侧的容器底面为滤膜。向下侧容器中的培养基中加入细胞引诱剂，并通过计数在滤膜上方培养的细胞穿透滤膜的孔移动到下方的细胞来检测浸润度。因为该容器可直接用于细胞共培养，后来也被长期使用。

       由于Boyden chamber是为了检测细胞的浸润以及移动能而开发，所以接种的细胞数量较少。细胞数量少的话，部分滤膜孔就不会被细胞堵塞，就可上下共用培养基。而细胞数多的话，就会堵塞滤膜孔，降低或停止共用培养基。然而，这一显而易见的事实并未受到太多关注，插入式细胞培养板仍成为了共培养的标准容器。并不是细胞数量少就无法共培养，但因为无法直接观察上侧容器中的细胞，所以一不留神细胞可能就会融合（细胞面积占有率高）。这时，就会在没有意识到这并不是共培养的情况下，进行结果分析。实际上，只要分析电子显微镜照片的结果就可进行确认（图1）。

球体·类器官共培养的范式转移

图1. 滤膜部分的电子显微镜图像

在UniWells中，由于细胞与过滤孔的位置相隔较远，即使细胞数量多也不会堵塞过滤孔。

2）关于三维共培养

MPS的目标是模拟人体。人体的各个器官处在不同的位置，无需直接接触，通过血液与组织液进行信息以及物质的双向交换，或是单向作用。为了模拟这些，需要迷你器官之间不经过直接接触就能够进行物质交换和影响的构造，以及共培养和单向作用的构造。此外，由于MPS为实验，所以还需评估实验误差。换言之，需要将类器官间的共培养和单向培养、多个类器官同时评估技术纳入重要技术。

在MPS中，已开发大量采用微通道技术的系统，而UniWells™ 采用的滤膜，就是通道长度非常短的微通道集合体。另外，通过上述的滤膜位置关系，UniWells™ 具有不堵塞通道，进行细胞和球体/类器官培养的优势。为了进一步优化UniWells™，敝公司目前正致力于将其球体、类器官和MPS化。作为优化第一弹，于2023年发售可安装在UniWells™上使用的PDMS制适配器UniWells-Cups（暂定名）。该产品利用了微加工技术和PDMS制造技术，与住友理工株式会社共同开发的UniWells™ 任选产品。可使用UniWells™ 共培养多个球体或类器官，还能进行各种组织学的评估。众所周知，球体和类器官各不相同。该系统可以同时共培养多个球体和类器官，因此可以在相同的实验条件和染色条件下同时评估球体阵列。

球体·类器官共培养的范式转移

图2. UniWells-Cups：Ginreilab Inc.和住友理工株式会社共同开发的产品

作为优化第二弹，预计今后将推出MPS设配器。

◆参考文献

1. Boyden, S. et al. : J. Exp. Med., 115 （3）, 453 （1962）.

2. Sutherland, R.M. et al. : J. Natl. Cancer. Inst., 46, 113 （1971）.

3. Jubelin, C. et al. : Cell. Biosci., 12, 155 （2022）.

4. The FDA Modernization Act 2.0. Available onlineより
4. （https://www.congress.gov/bill/117th-congress/senate-bill/5002 （2023年1月29日）.

5. Shimasaki, T. et al. : Micromachines （Basel）, 12 （11）, 1431 （2021）

◆产品列表

产品编号

产品名称

用途

包装

384-14421

UniWells™ 水平共培养板

培养容器（材质：聚苯乙烯）

10 set

381-14431

UniWells™ 滤膜0.03 μm

专用滤膜（孔径0.03 μm）

50片

388-14441

UniWells™ 滤膜0.6 μm

专用滤膜（孔径0.6 μm）

50片

388-17001

UniWells™ 共培养板适配器96

96孔板尺寸支架

可放置8个 UniWells™培养板

1个

点击此处查看相关产品：水平连接细胞共培养板UniWells™

细胞库实践综合指南

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细胞库实践综合指南

细胞培养的有效管理对于保持其在研究和治疗应用中的完整性至关重要。细胞系的连续或长期培养会导致各种并发症，例如:

  • 微生物污染:

    开放培养容易受到各种微生物感染，这些微生物会改变细胞行为和生存能力。

  • 特征变化:

    关键的细胞特征，如抗原表达或抗体产生，可能会随着时间的推移而丢失。

  • 遗传变异:

    基因组不稳定性可能发生在以核型不稳定而闻名的细胞系中，从而导致不可靠的实验结果。

  • 寿命限制:

    某些类型的细胞在进入衰老和停止增殖之前分裂次数有限。

  • 交叉污染风险:

    长期培养增加了一个细胞系污染另一个细胞系的风险，从而导致错误的数据。

  • 资源密集度:

    长期培养需要更多的消耗品和劳动力，大大增加了成本。

细胞库的战略方法

细胞库系统是减轻上述风险的战略方法。推荐的系统是主小区银行系统，包括以下步骤:

  1. 初始隔离:

    新获得的细胞培养物应在严格的检疫条件下隔离和处理，以防止实验室污染。

  2. Token Stock Establishment:

    初始培养扩增后，应冷冻保存少量安瓿瓶（3-5瓶）作为应急备用的象征性储备。

  3. 主细胞库形成:

    从代币储备安瓿瓶扩大培养物，以建立由大量安瓿瓶组成的主细胞库（10-20个或更多，根据计划使用情况而定）。

  4. 严格的质量控制:

    主细胞库的一个子集经历了全面的质量控制测试，其中包括评估细胞活力，确认不存在微生物污染物，并可能进行病毒和真实性测试。

  5. 工作细胞库的开发:

    然后使用主细胞库的一部分创建工作细胞库，这是积极研究和应用的主要来源。

详细的质量控制协议

质量控制是维护细胞库的关键部分。它包括:

  • 生存力和计数测试:

    确保细胞存活且数量充足。

  • 微生物筛选:

    定期检测细菌、真菌和支原体以防止细胞培养受损。

  • 认证程序:

    通过DNA分析等方法确认细胞系的身份。

存储和使用建议

正确的储存条件如下:

  • 专用存储设施:

    利用专门为储存细胞库设计的设施，如液氮罐或电冰柜，以防止交叉污染并确保长期生存能力。

一致性和质量保证:

  • 一致的细胞材料:

    细胞库系统确保实验中使用的所有材料都来自一致的来源。

  • 受控通道数:

    通过使用在可控传代次数范围内的细胞，实验可变性被最小化。

  • 适时文化实践:

    仅在必要时培养细胞有助于保持细胞系的原始特性，并降低与保持连续培养相关的成本。

细胞培养板的选购要看哪些因素

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细胞培养板的选购要看哪些因素

　　细胞培养板在进行细胞操作时同样遵循严格无菌的原则，各项操作要保证规范、科学，不对细胞的生长造成额外的影响。
　　细胞培养板的选择
　　1)细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型)；
　　2)培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；
　　3)根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。
　　平底和圆底(U型和V型)培养板的区别和选择
　　1)贴壁细胞一般用平底培养板。
　　2)悬浮型细胞的培养一般用V型。
　　3)U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。
　　4)V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。
　　不同型状的板子自然有不同用途
　　平底的什么类型的细胞都可用，但当细胞数目较少，如做克隆时，就用96孔平底板。
　　另外﹐做MTT等实验时﹐无论贴壁和悬浮细胞﹐一般均用平底板。
　　至于U或V型板﹐一般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面﹐当做两种不同淋巴细胞混合培养时﹐需要二者相互接触以刺激。因此﹐一般需要U型板﹐因细胞会由于重力的作用而聚集在一个很小的范围內，V型板的用途更少﹐一般用于细胞杀伤实验时﹐为了使效靶细胞紧密接触﹐常使用V型板﹐但这种实验也可用U型板替代(加入细胞后﹐低速离心)。
　　如果是养细胞的话， 通常是运用平底的， 另外要特別注意材质， 标示”Tissue Culture (TC) Treated”就是养细胞用的。
　　圆底的通常是拿来做分析， 化学反应， 或是保存样品用。因为圆底比较好将液体吸得干净， 如果用平底的就不好吸了。 不过， 如果你是要测吸光值的话， 一定要买平底的才行。
　　大部分细胞培养都用平底培养板，便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致，还便于MTT检测。
　　圆底培养板主要用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等

bigelow培养方法介绍

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bigelow培养方法介绍

培养基类型

富集培养基和人工培养基是培养基的两种主要类型。富集培养基通常通过以下两种方式制备：(1) 通过将土壤或土壤提取物添加到蒸馏水或天然水中，或 (2) 通过将营养化学品添加到天然水（例如海水或湖水）中。人工介质仅使用“纯”水和“纯”化学品；它不包括添加未定义的土壤或天然湖泊或海水。然而，认识到即使是精心制备的人工培养基中也存在未知的“杂质”，这一点非常重要。

富含土壤和水的介质适合维持藻类培养。良好的土壤提供无机和有机物质——藻类生长良好，并且培养引起的形态变化是有限的。

通过化学浓缩海水制备的海洋介质很常见。然而，使用湖水或河水进行化学富集的淡水培养并不常见。相反，人工培养基对于许多淡水藻类的生长来说很常见并且非常成功，但仅当无法使用天然海水基础进行关键研究时才使用海洋人工培养基。例如，出于研究微量元素的目的，使用精心定义的人造海水介质来最小化或排除已知污染物。

类似地，水质、玻璃/塑料器皿清洁度等以与化学质量相同的方式影响培养基，即不良或有毒物质的存在以及所需物质的缺乏会影响藻类生长。培养基和培养容器可以通过蒸汽高压灭菌、巴氏灭菌、过滤或微波进行灭菌。

培养容器和材料

用于培养培养物和储存培养基的所有容器和管道均应仔细选择，以避免有毒化合物。我们推荐使用硼硅酸盐玻璃或组织培养级聚碳酸酯和聚苯乙烯塑料器皿制成的烧瓶和试管。黑色试管螺帽应在海水变化时高压灭菌几次，因为新瓶盖在加热时可能会释放出有毒的酚类物质。

同样，橡胶塞（或任何其他在加热时释放有气味的挥发性化合物的东西）应与介质分开进行高压灭菌。应避免使用带有铜管的老式高压灭菌器，因为过量的铜对藻类有毒。高压灭菌器蒸汽本身可能被金属污染，并且培养基可能对开放海洋物种产生金属毒性。

新的玻璃器皿应在稀 NaOH 中脱脂。玻璃器皿可以定期用稀盐酸清洗，或者，如果担心金属污染，建议在浓盐酸中长时间浸泡。玻璃器皿不应该用铬酸清洗，因为铬对许多浮游植物有毒。烧瓶可以用用粗棉布、硅胶海绵包裹的棉塞或用烧杯盖住的塞子盖住。由箔或塑料烧杯制成的盖可以防止真菌在潮湿的塞子中生长。

大多数科学家在准备培养物时会丰富天然海水。海水来源可能会影响成功。一些沿海水域的盐度降低，某些菌株可能无法忍受。NCMA 使用来自缅因湾的原始水，其盐度约为 32 psu。在水华期间不应收集海水，特别是当存在有毒生物时。可以使用过滤器（例如 0.45 µm 玻璃纤维过滤器）去除天然浮游植物。可以通过添加来去除溶解的有机污染物每升加入一到几克活性炭粉末并充分混合。第二天通过倾析和过滤除去碳。

为了简化常规培养基制备，通常制备工作储备溶液。添加少量液体储备溶液比称量单个干化学品更容易、更快捷。最好将原液添加到水中并混合 – 直接混合原液而不用水稀释可能会导致不良沉淀。营养强化剂要么在灭菌前添加，要么在灭菌后无菌添加。灭菌是通过在 121°C、15 lb/in2 下高压灭菌 15 分钟或更长时间来完成，具体取决于所涉及的体积。高压灭菌后应尽快冷却培养基以避免沉淀。二氧化硅可以增强沉淀，因此如果藻类不需要硅，最好将硅酸盐排除在培养基之外。

营养物质可能会被细菌或真菌污染。因此，谨慎的做法是首先对原液进行高压灭菌，然后采用良好的无菌技术。应仔细密封储备溶液，因为蒸发会浓缩营养储备。维生素库存可以冷冻很长时间而不会明显降解。在玻璃容器中高压灭菌 Na2SiO3 储备溶液可能会导致二氧化硅蚀刻或碎片状沉淀。因此，我们建议在聚四氟乙烯涂层瓶中制备硅酸盐储备溶液。

高压灭菌后，培养基应放置约 24 小时，同时气体（尤其是 CO2）扩散到液体中。通过快速冷却可以最大限度地减少沉淀。对于大多数海水介质来说，最终 pH 值为 7.8-8.2 是理想的。

细菌保存指南：冷藏、冷冻和冷冻干燥

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细菌保存指南：冷藏、冷冻和冷冻干燥

在原种培养物、突变菌株和基因工程变体之间，任何一个实验室可以积累的单个细菌培养物的数量可能很多。事实上，在设计一个质粒的过程中产生的变异数量可能是惊人的。大多数实验室都会保留所有这些和其他变化，因为你永远不知道明天可能需要什么。因此，保存所有这些细菌培养物和遗传变异是需要深思熟虑的事情。 

加盖试管中的细菌培养物处于封闭环境中。尽管培养物开始时可能是健康的，但随着时间的推移，活细胞的数量将减少到零。保存培养物的目的是降低死亡率，以便在重新进行培养物时，一些细胞仍然存活并可用于培养。细胞死亡的原因可能有很多，但在每种情况下都是基于细胞及其环境的固有化学性质。如果有害的化学反应可以减慢或停止，那么整个培养物将在更长的时间内保持活力。   

有两种基本方法可以减缓细菌培养物中有害反应的速度。第一个是降低温度，从而降低所有化学反应的速率。这可以使用冰箱、机械冷冻机和液氮冷冻机来完成。第二种选择是从培养物中去除水，这个过程可能很棘手，并且涉及使用冻干机升华水。   

以下是保存细菌的主要选择的简要讨论。报告了每个选项的优点和缺点。 

冷藏

细菌在 4°C 下可以短暂存活。对于每天或每周使用的菌株，在琼脂斜面或平板上生长的培养物可以储存在冰箱中，前提是已采取预防措施以避免污染。应使用标准技术制备培养物，然后在储存前密封。对于倾斜，我们建议使用螺旋盖管。对于培养皿上的培养物，需要用封口膜密封培养皿。密封板不仅有助于防止霉菌潜入板中，而且还能减缓琼脂的干燥速度。对于超过一周或两周的情况，培养物可以以刺的形式储存在小平底螺旋盖小瓶中。在该技术中，小瓶中充满少量琼脂培养基（例如1ml）并灭菌。然后用无菌针将细菌引入固化的琼脂中。将培养物用松盖孵育过夜，然后用紧盖保存在 4°C 下。储存在刺棒中的培养物更能抵抗干燥和污染，但它们会比冷冻储存更快地失去活力。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。 

冷冻

冷冻是储存细菌的好方法。一般来说，储存温度越低，培养物保留活细胞的时间越长。冷冻柜可分为三类：实验室冷冻柜、超低温冷冻柜和低温冷冻柜。储存在冰箱中的细菌（和其他细胞）面临的问题是冰晶。冰会因局部盐浓度增加导致脱水而损害细胞。当水转化为冰时，溶质积聚在残留的游离水中，这种高浓度的溶质会使生物分子变性。冰也会使细胞膜破裂，尽管这个问题通常与缺乏细胞壁的细胞有关，例如培养的动物细胞。为了减轻冷冻的负面影响，甘油经常被用作冷冻保护剂。许多鱼类和昆虫都会产生甘油，通过降低细胞的冰点、增强过冷以及防止结冰来抵御寒冷的温度。对于细菌，添加甘油至终浓度 15% 将有助于保持细胞在所有冷冻条件下存活。以下是每个冷冻机类别的一些具体信息。 

实验室冷冻柜可以将温度降低至 -20 至 -40°C。这些是单级系统（一台压缩机），通常称为通用冷冻机。细菌可以在通用冰箱中保存中等时间，例如1年。最好使用没有无霜温度循环的冰箱，因为这会对细胞和其他温度敏感的生物分子造成严重破坏。通用冰箱价格便宜，在大多数实验室都有，因此它们很容易用于储存培养物。缺点是它们的温度不够低，无法长期储存。 

超低温冰箱是两级系统（两个压缩机，每个压缩机具有不同的制冷剂），可降至 -86°C 左右。超低温冰箱非常普遍，但其中的空间有时可能有限且竞争激烈。超低温冰箱的购买、运行和维护成本也高得多。好处是，储存在 -80°C 下的细胞往往可以保持存活数年。超低温冰箱产生的较低温度大大减少了培养物内的化学反应。然而，冷冻细胞中仍然发生分子运动，因此培养物的活力将会下降。定期监测培养物以评估其生存能力非常重要。   

低温冷冻柜非常冷，依靠液氮或专门的机械系统来运行。对于生物样品，低温储存应低于-130°C。在此温度下，水的分子运动停止，细胞被困在玻璃状基质中。储存在低温冰箱中的细菌可以保持其活力多年。在我们的实验室中，细菌和酵母培养物已在 -140°C 下保存 15 年，活力没有明显丧失。与冷冻干燥相比，在低温冰箱中储存细胞是有效且简单的长期储存方法。其缺点是成本以及库存对停电、机械故障和液氮交付失败的潜在脆弱性。此外，管子切勿存放在浸没液氮的罐中。螺旋盖管泄漏，会将氮气和污染物一起吸入管中。液氮气相冷冻机将有效地避免这个问题，但这些冷冻机非常昂贵（高达1万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。但这些冷冻机非常昂贵（高达 1 万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。但这些冷冻机非常昂贵（高达 1 万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。   

冷冻干燥

在水系统（例如活细胞）中，水不仅充当酶促反应的介质，而且还充当自发的负面反应（例如自由基形成）。除去水会停止酶促反应和非酶促反应。冷冻干燥是去除这种水的一种方法。通过冷冻干燥可以非常有效地保存许多细菌。通过将细胞冷冻在含有冻干保护剂（通常是蔗糖）的介质中，然后使用真空吸出水（升华），可以有效保存细胞。这种方法很费力，需要专门的设备，但它的优点是可以产生不受停电和空液氮罐影响的原种培养物。此外，如果培养物定期运送到其他实验室，冻干培养物不需要特殊处理。冷冻干燥的缺点是并非所有培养物都以相同的方式反应，因此需要进行一些实验来优化每种菌株的工艺。对于任何认真生产和维护培养物保藏的实验室，冷冻干燥应作为主要的保存方法。