间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发


间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

外泌体再生医学的实现之路

间充质干细胞来源外泌体产生用无血清培养基的研发

富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所

丸谷祐树、山根昌之

◆前言

细胞外囊泡(Extracellular vesicle : EV)是由细胞释放的脂质双分子层包被的膜囊泡,作为细胞间的通讯工具发挥作用。外泌体属于EV的一种,被认为参与多种生物功能的控制,并有望用作疾病生物标记物或治疗制剂。在治疗制剂的应用方面,具有抗炎和抗纤维化作用的间充质干细胞(Mesenchymal stem cell:MSC)来源外泌体备受瞩目,其未来的实用性被寄予厚望。对MSC来源外泌体实际应用的期望不断提升,同时外泌体作为治疗制剂的生产技术研发也在积极进行。

本文将介绍由FUJIFILM Wako自主研发的无血清培养基,在生产用于治疗的MSC来源外泌体方面的实用性。

 

◆MSC来源外泌体

以CD9、CD63和CD81等作为标记蛋白的外泌体,由细胞释放的、直径在30-100 nm左右的脂质双分子层包被的膜囊泡,含有蛋白、核酸(DNA、mRNA、miRNA)、脂质等细胞来源成分1,2)。另外,MSC来源于中胚层的成体干细胞,能够从骨髓、脂肪、脐带等组织中建立,具有分化为脂肪、骨骼和软骨的功能。除此之外,MSC还具有诱导抗炎、抗纤维化或免疫抑制等旁分泌效应,近年来有人提出这些作用是由外泌体引起的3)。在此背景下,将MSC来源外泌体作为治疗制剂的关注度急剧攀升。

 


◆MSC来源外泌体产生用无血清培养基的研发背景

关于在产生MSC来源外泌体时所用的培养基,起初使用的是几种添加了不含牛来源外泌体的胎牛血清(EV-depleted FBS)的基础培养基4,5)。然而,这些组分均以维持MSC存活为目的,能够优化外泌体分泌和生物活性效果的组分尚未研发成功。

为此我们研发了一款可为MSC产生外泌体提供适宜的环境的无血清、无动物培养基,即为可同时维持高性能和高生物活性的EV-Up™基础培养基及补充剂(下称EV-Up™培养基)。

 


◆使用EV-Up™培养基培养获得的外泌体产量及活性

EV-Up™培养基的推荐使用方法是,在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合,然后更换培养基并培养 3-5 天(图1)。从血清培养基更换为无血清培养基时,多数情况下都需要进行驯化操作,但在含FBS的血清培养基中增殖的细胞,也能够直接更换EV-Up™培养基培养。

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图1. EV-Up™培养基的建议操作流程

           在任意的增殖培养基中培养至80-90%汇合后,更换至EV-Up™培养基。然后培养 3-5 天,回收培养上清。可以通过PS亲和法从回收的培养上清液中回收外泌体。

 


在血清培养基中使骨髓来源的MSC增殖,然后更换至含EV-depleted FBS的基础培养基或EV-Up™培养基中,检测培养5天后的细胞数和细胞生存率。结果显示,细胞数和细胞生存率均维持在较高的状态下(图2 – A、B)。

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图2. 使用EV-Up™培养基培养MSC的细胞生存率

更换至EV-Up™培养基5天后,测得的细胞数(A)和细胞生存率(B)。

 


接着,利用纳米粒子追踪分析法(NTA)比较使用PS亲和法纯化的外泌体粒子数6)。结果表明,使用EV-Up™培养基获得的外泌体,其粒子数约为使用含EV-depleted FBS的基础培养基的2.6倍(图3A)。进一步通过基于PS亲和法外泌体定量技术的PS ELISA比较外泌体产量,可确认和粒子数一样,外泌体标记蛋白CD9、CD63 和CD81都有所增加6,7)(图3 B)。

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图3. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体粒子数及外泌体标记蛋白

从各培养基中取培养上清1 mL,通过NTA比较获得的外泌体粒子数(A)以及通过PS ELISA分析外泌体标记的结果(B)。

最后,评估对人胎肺来源正常成纤维细胞(TIG3)的纤维化抑制效果,以比较在各培养基中培养的MSC来源外泌体的生物活性。结果表明,相比常规使用的基础培养基和含EV-depleted FBS的培养基,采用EV-Up™培养基培养的MSC来源外泌体具有更好的抗纤维化效果(图4)。

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图4. 比较使用EV-Up™培养基培养后的外泌体生物活性(抗纤维化活性)

向TGFβ刺激的人胎儿肺源性成纤维细胞(TIG3细胞)中添加PS亲和法纯化的外泌体5×108 particles/mL,

利用Real-Time PCR法定量纤维化标记(αSMA,Collagen Ⅲ)的基因表达,比较抗纤维化活性。           

 


以上结果显示,EV-Up™培养基可以高产量制备维持高生物活性的MSC来源外泌体,是一款创新性的培养基。

 

◆结语

此次我们研发的EV-Up ™培养基是针对MSC优化的无血清、无动物来源的外泌体生产用培养基,不仅能提升高活性外泌体的产量,因其无血清、非动物源,还可能有助于提高治疗制剂开发过程中的质量稳定性。今后使用外泌体作为治疗制剂的应用化将会在世界范围内不断发展,期待我们研发的培养基作为实用的生产技术工具得到广泛运用。

〔参考文献〕


1) Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255(2014).

2) Mathieu, M. et al. : Nat. Cell Biol., 21(1), 9(2019).

3) Phinney, D. G. and Pittenger, M. F. : Stem Cells, 35(4), 851(2017).

4) Rajendran, R. L. et al. : Sci. Rep., 7(1), 15560(2017).

5) Lai, R. C. et al. : Stem Cell Res ., 4(3), 214(2010).

6) Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935(2016).

7) Ma, Y. et al. : Sci. Rep., 11(1), 13471(2021).

◆相关产品

产品编号

产品名称

等级

包装

053-09451

EV-Up™ EV Production Basal Medium for MSC, AF
EV-Up™ 间充质干细胞外泌体生产用基础培养基,无动物源成分

细胞培养用

95 mL

298-84001

EV-Up™ MSC EV Production Supplement, AF
EV-Up™ 间充质干细胞外泌体生产用添加剂,无动物源成分

细胞培养用

5 mL(100 mL用)

294-84101

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2
MagCapture™外泌体提取试剂盒PS Ver.2

基因研究用

2 tests

290-84103

基因研究用

10 tests

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