GenomONE ® 仙台病毒包膜细胞融合试剂 GenomONE ® – CF EX SeV-E (HVJ-E) Cell Fusion Reagents

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GenomONE ® –CF EXGenomONE ® 仙台病毒包膜细胞融合试剂                               GenomONE ® - CF  EX SeV-E (HVJ-E) Cell Fusion Reagents

GenomONE ® 仙台病毒包膜细胞融合试剂



GenomONE ® 仙台病毒包膜细胞融合试剂                               GenomONE ® - CF  EX SeV-E (HVJ-E) Cell Fusion Reagents

  GenomONE®CF EX 含有仙台病毒包膜和专用缓冲液,可促使细胞融合。

适用于贴壁/悬浮状态的所有细胞,仅需 30 min,即可制备融合细胞和杂交瘤。


◆用途


 制备杂交瘤

● 应用于癌细胞与树状细胞融合的癌症免疫研究

● 应用于内脏来源细胞与干细胞融合的再生医疗研究

● 应用于去核未受精卵的核移植等的发育、繁殖和育种研究

● 替代电融合法、PEG 法

HVJ Envelope(HVJ-E):


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  HVJ 包膜(HVJ-E)是完全灭活和纯化仙台病毒(HVJ*),即只留下细胞膜融合能力的衣壳蛋白包膜。仙台病毒的HN蛋白可与细胞膜外的唾液酸受体结合,通过F蛋白的作用,引起细胞膜融合。在 HVJ-E 中,仙台病毒的基因组 RNA 已经完全失活,在人类和实验动物体内不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和设备,它可以安全地在普通的实验室使用。

*HVJ:日本仙台病毒


HVJ-E 细胞融合原理


在低温(0 – 8℃)条件下,每一个细胞与数百个以上的 HVJ – E 接触,HVJ – E 与细胞膜上的唾液酸受体结合,通过细胞表面吸附(步骤1),细胞通过 HVJ-E 相互连接(步骤2),形成细胞彼此聚集的状态。当该细胞/HVJ-E 的复合物加热到 37℃ 时,细胞膜干扰就会进一步扩大,细胞膜内膜结构也暂时改变。这种变化是短暂的,随后会立即返回到正常结构,但是在这个期间,细胞膜利用强疏水性结合力进行相互融合(步骤3)。

步骤一 步骤二 步骤三
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应用方法

悬浮法 电融合法
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悬浮细胞融合案例


同种细胞融合
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异种细胞融合

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  荧光标记的红(* 1)细胞和绿色荧光标记(* 2)细胞(每1.0×105个)在融合缓冲液 50 μL 混合后,加入 HVJ-E 冰敷5分钟,随后 37℃ 下反应 15 分钟后,融合细胞(黄色)进行了观察。



黏着态和悬浮态细胞融合案例


在粘合状态BHK-21(红)和在浮动状态(绿色)的P19细胞的融合

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胶粘状态的HeLa S3(红)在浮动状态(绿色)的P19细胞的融合

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  荧光标记的(* 1)中的红,附着的细胞在 12 孔平板,绿色荧光标记(* 2)中,添加预先准备的 HVJ-E,来处理漂浮细胞1×105个的悬浮液(融合缓冲污染),并在室温下离心(1000转),每个板5分钟。随后孵育37℃15分钟后,更换增殖用的培养基继续细胞培养。观察3个小时后的融合细胞(黄色)。



和 PEG 法的比较

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  红色荧光标志(* 1)的 ratMSC(骨髓由来老鼠间叶系细胞)和绿色荧光标识的老鼠原代培养心肌细胞2×105个融合缓冲液 50 μL 中混合后,添加 HVJ – E,冰浴5分钟,然后 37℃ 孵育反应15分钟,观察融合细胞(黄色)。1-2日培养后,观察到粘着的融合细胞。在 PEG 法中融合紧接之后细胞毒性强烈,融合细胞的数量很少。



◆安全性说明


HVJ-E 失活的确认(确认无感染性病毒的存在)


1. 

细胞增值实验(荧光灶单元(FFU)法)

处理 LLC-MK2 细胞,一到两天后,病毒生长性的 HVJ 融合蛋白F抗体通过荧光抗体法测定,已证实未检测到病毒蛋白。<制造阶段实验>

2. 

受精卵生长试验(血凝单位测定)

处理受精卵,3天后的病毒增殖,包括在 HVJ 表面的 HN 蛋白的红血细胞聚合活性(HAU)测量作为指标,已经证实,没有看到病毒的生长。<制造阶段实验>

3. 

小鼠感染性研究

鼻腔给药小鼠和未处理小鼠(SIX周)在相同笼中饲养,通过测定血清中的抗 HVJ 抗体滴度进行了个体之间感染性的检测。其结果是,在非给药的情况下未观察到抗体滴度增加,表明未感染 HVJ-E。

4. 

动物个体的遗传基因导入实验

小鼠、大鼠等实验动物的各种药物实验(肺、气管、肝和静脉等)。已证实完全没有病毒感染或是可疑的事例


相关资料


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GenomONE CF 细胞融合试剂

说明书

GenomONE CF 细胞融合试剂

用户反馈

GenomONE全系列

Q&A

Q1:什么是GenomONE®CF EX?
A1GenomONE®CF EX 是由 HVJ 包膜(HVJ-E)和特殊缓冲液组成的细胞融合试剂盒。 它可以用于贴壁细胞和悬浮细胞。 使用该试剂盒

A1:融合相同或不同类型的细胞只需30分钟。


Q2:HVJ-E的特性?
A2:HVJ包膜是通过完全灭活的仙台病毒(HVJ:日本血凝素病毒)纯化后的产物。 它是一种囊泡,其中仅保留
仙台病毒具有细胞膜融合能力

        的包膜蛋白。 众所周知,在鞘膜外耳炎(包膜)仙台病毒中的HN蛋白能识别细胞膜上的受体(在糖链的末端具有唾液酸)并且将其吸收,

        从而通过F蛋白(包膜的另一组分)介导膜融合。 HVJ-E中包含的仙台病毒基因组RNA已经完全灭活,并且在人或实验动物中既不能感染

        也没有增殖潜力。HVJ-E可以在普通实验室中安全使用,无需任何特殊操作或设施。


Q3:失效日期?
A3:在铝纸包装上印刷了冻干的 HVJ-E 的保质期。


Q4:对于 HVJ 灭活方法?
A4:虽然HVJ-E使用HVJ(仙台病毒/鼠副流感病毒1)作为原料,但HVJ的基因组RNA已经通过药物治疗而完全灭
活*。 HVJ-E不会在人或动物

        中增殖或表现出致病作用。

A4:参考文献:Prior, P. et al.: BioPharm, 22-33 (Oct. 1996) Kaneda, Y. et al.: Advances in Genetics, 53, 308-332 (2005).


Q5:病毒灭活的评估和确认?
A5:通过对培养的细胞和生长的鸡蛋进行病毒增殖性电位排除试验,证实了每批的 HVJ 已经失活。


Q6:确认病毒灭活的方法?
A6:通过以下三种方法证实了在人或实验动物中缺乏HVJ-E的感染或增殖的可能性。
A6:(1)使用培养细胞的测定
A6:(2)使用受精的鸡蛋进行测定
A6:(3)使用小鼠进行测定


Q7:实验室生物实验安全级别,使用注意事项?
A7:GenomONE® 可以在普通实验室安全使用。虽然 HVJ-E 使用 HVJ(仙台病毒/鼠副流感病毒1)作为原料,
但HVJ的基因组RNA已经通过

        药物治疗而完全灭活。 HVJ-E不会在人或动物中增殖或表现出致病作用。

        然而,当使用该产品进行细胞融合实验时,产生的重组生物体等可能属于卡塔赫纳生物安全议定书的限制。

        使用本产品生产重组生物体的实验者必须采取适当措施,防止此类生物体扩散,然后再使用本产品进行实验。
        此外, DNA 重组实验,必须遵循重组 DNA 实验规则(在使用国的相关法规中规定或由相关设施的安全委员
会规定),并且实验只能在具

        合适设施的实验室中进行 DNA 重组实验。


Q8:质量保证?
A8:
A8:◆ 通过对培养细胞和受精鸡蛋的病毒增殖性电位排除试验,确认每批 HVJ 的灭活。
A8:◆ 无菌检测证实了不存在细菌和真菌污染。
A8:◆ 内毒素水平已被证实小于 2.5 EU / mL(鲎细胞裂解物凝胶凝块测定)。


Q9:许可证要求和商业用途?
A9:本产品由一个或多个专利的权利要求所覆盖,并且仅授予研究用途。 未经制造商事先书面许可,不得用于任

A9:何商业或其他目的,或在修改后转售等(Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.)。


Q10:每种试剂的作用?
A10:
A10:◆ 冻干的 HVJ-E:HVJ-E 是通过完全灭活 HVJ(仙台病毒)制备的纯化囊泡,其中仅保留 HVJ 具有细胞膜融
合能力的包膜蛋白。

A10:◆ HVJ-E悬浮缓冲液:用于复融,重悬,稀释 HVJ-E 或其他目的的生理浓度的中性缓冲液。
A10:◆ 细胞融合缓冲液:用于细胞融合的优化缓冲液。
A10:◆ “细胞融合缓冲液(20X浓缩物)”应在使用前用无菌纯水(例如,不含内毒素的注射用水)以1:20 
稀释。


Q11:每种试剂的成分和浓度?
A11:无相关数据


Q12:重组 HVJ-E 悬浮液的储存?
A12:
A12:◆ 为了连续使用,请在冰箱(2-8°C)存放最多两个星期。
A12:◆ 对于长期储存,根据每次使用量将试剂分装保存在 -80℃ 下冷冻最多3个月。 冷冻后只能解冻一次。


Q13:“HVJ-E 悬浮缓冲液”和“细胞融合缓冲液(20X)”的保存?
A13:储存在冰箱(2-8°C)。 不要冻结。


Q14:HVJ-E 的粒度?
A14:约 300 nm(200-400 nm)


Q15:HVJ-E 颗粒数?
A15:40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液包括约 109-1010 个 HVJ-E 颗粒。


Q16:HVJ-E 的血细胞凝集单位(HAU)?
A16:40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液,相当于约 1,000-2,000个血凝单位(HAU)。


Q17:使用频率?
A17:
A17:◆ 对于相同或不同类型的细胞的融合:约 100 次
A17:◆ 用于制备B细胞杂交瘤:约 10 次

参考文献

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产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
388-18721  GenomONE ® – CF EX SeV-E (HVJ-E) 1 vial Cell Fusion Reagents
 GenomONE ® – CF EX 仙台病毒包膜(1只装)细胞融合试剂 
1 set
384-18723  GenomONE ® – CF EX SeV-E (HVJ-E) 1 vial Cell Fusion Reagents
 GenomONE ® – CF EX 仙台病毒包膜(1只装)细胞融合试剂 
4 sets
382-18724  GenomONE ® – CF EX SeV-E (HVJ-E) 1 vial Cell Fusion Reagents
 GenomONE ® – CF EX 仙台病毒包膜(1只装)细胞融合试剂 
16 sets

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